Ressonância Magnética Funcional (fMRI), com estimulação auditiva em aves canoras

Resumo

Este artigo mostra um procedimento otimizado para imagens dos substratos neurais da estimulação auditiva no cérebro songbird usando ressonância magnética funcional (fMRI). Ele descreve a preparação dos estímulos sonoros, o posicionamento do sujeito e da aquisição e posterior análise dos dados de fMRI.

Resumo

A neurobiologia do canto dos pássaros, como um modelo para a fala humana, é uma área pronunciado de pesquisa em neurociência comportamental. Considerando eletrofisiologia e molecular abordagens permitem a investigação de qualquer diferentes estímulos em alguns neurônios, ou um estímulo em grandes partes do cérebro, o nível de oxigenação do sangue dependente (BOLD) Ressonância Magnética funcional (fMRI) permite combinar as vantagens, ou seja, comparar a ativação neural induzida por diferentes estímulos em todo o cérebro de uma só vez. fMRI em pássaros é um desafio por causa do pequeno tamanho de seus cérebros e porque os seus ossos e, especialmente, seu crânio compreendem inúmeras cavidades de ar, induzindo importantes artefatos de suscetibilidade. Gradiente-eco (GE) fMRI BOLD tem sido aplicado com sucesso para pássaros ^1-5 (para uma revisão, ver ^6). Estes estudos se concentraram nas áreas primárias e secundárias auditivas cerebrais, que são regiões livres de artefatos de suscetibilidade. No entanto, devido proccessos de interesse pode ocorrer para além dessas regiões, todo o cérebro fMRI BOLD é necessário utilizar uma seqüência de ressonância magnética menos suscetíveis a esses artefatos. Isto pode ser conseguido através da utilização de spin-eco (SE) NEGRITO RMf ^7,8. Neste artigo, descrevemos como usar esta técnica em tentilhões-zebra (Taeniopygia guttata), que são pequenos pássaros com um peso corporal de 15-25 g extensivamente estudado em neurociência comportamental do canto dos pássaros. O principal tema de estudos de fMRI sobre pássaros é a percepção da música e aprendizagem da música. A natureza auditiva dos estímulos combinados com os fracos sensibilidade BOLD de SE (em comparação com GE) seqüências de fMRI baseados faz com que a implementação desta técnica muito desafiador.

Protocolo

1. Preparação dos estímulos auditivos

1. Primeiro gravar o som-estímulos ao ser jogado dentro do furo do sistema MR 7T. O furo é de um espaço confinado, que pode distorcer os estímulos auditivos, resultando na melhoria de determinadas frequências auditivas. Figura 1 mostra as frequências aumentadas e suprimida, como mostrado pelas nossas gravações de ruído branco feito no local da cabeça da ave no magneto usando um microfone de fibra óptica (Optimic 1160, Optoacoustics). Para compensar este aumento artificial, uma função de equalizador é aplicada a cada estímulo usando o software WaveLab. Para nossa configuração particular, a função consiste em um kernel gaussiano com os seguintes parâmetros: amplitude máxima:-20dB, centrado em 3750 Hz, largura: 0,05 oitavas (correspondente à faixa 2.500-5.000 Hz para o nosso sistema).
2. Os estímulos músicas são compostas por vários motivos músicas individuais de cada pássaro intercaladas com períodos de silêncio. O dguração destes períodos silenciosos é ajustado para manter a quantidade total de som e silêncio idênticas para todos os estímulos. Esta construção conserva a variabilidade intra-individual e inter-individual natural da duração da música. O comprimento total de cada estímulo é de 16 seg. A intensidade de cada canção é normalizada em termos de correspondência raiz quadrada média e high-pass filtrado a 400 Hz, antes de ser integrado ao estímulo completo (canção e períodos de silêncio). Essas manipulações são feitas utilizando o software Praat.
3. O experimento consiste de um botão ON / OFF projeto alternando períodos de estimulação auditiva bloco (em blocos) com períodos de descanso (OFF blocos) (Figura 2). Cada bloco (ON e OFF) dura 16 segundos, o que corresponde ao tempo de aquisição de duas imagens (veja abaixo para aquisição). Cada tipo de estímulo é apresentado 25 vezes, resultando na aquisição de 50 imagens por estímulo e por assunto. A ordem de apresentação das condições deve ser ao acaso dentro e entreassuntos. Esta ordem aleatória dos estímulos podem ser codificadas em software de apresentação.

2. Assunto Preparação

2.1 Sujeito eo tamanho do grupo

Aqui é apresentado um protocolo adaptado especificamente para a utilização de (adulto) mandarins. A escolha da espécie depende da pergunta científica. No entanto, outras considerações como ave robustez para anestesia pode também ser tida em conta. Zebra tentilhões (Taeniopygia guttata) devem ser alojados em viveiros sob 12 horas de luz: 12 horas de fotoperíodo escuro e ter acesso a comida e água ad libitum durante todo o estudo. O número mínimo de indivíduos por ensaio é 15. Esse número leva em conta a sensibilidade de fMRI spin-echo ea variabilidade inter-individual natural de fenômenos biológicos medidos no experimento.

2.2 Instalação de configuração e preparação do animal

(Para especificaçãodo equipamento utilizado, referimo-nos a lista de reagentes e equipamentos específicos no final do artigo)

1. Instalar a máscara bico na cama MRI de um sistema de MR T7 e conectá-lo ao dispositivo controlador de gás com tubos de plástico. Abra as duas garrafas de gás oxigênio e nitrogênio e ligar o dispositivo controlador de gás (oxigênio vazão: 200 cc / min; nitrogênio: 400 cc / min).

Como mencionado acima, um sistema de RM T7 é usado na configuração apresentada. Outros sistemas de RM com diferentes intensidades de campo também são possíveis, mas a T7 é alcançado um bom compromisso entre a relação sinal-ruído e grau de artefatos de suscetibilidade (ver discussão). Em mais elevadas intensidades de campo a relação sinal-para-ruído irá aumentar juntamente com o grau de artefactos de susceptibilidade.

2. Ligue o sistema de controle de feedback e um dispositivo de fluxo de ar quente.
3. Anestesiar o tentilhão com 3% de isoflurano em uma mistura de oxigênio e nitrogênio através da introdução de seu bicona máscara e segurando a cabeça para baixo até que a ave está totalmente anestesiado. Isto pode ser verificada por meio de puxar o pé suavemente: quando a ave está completamente sedado o pé não vai ser retraído pela ave. Além disso, os olhos da ave irá ser parcialmente fechada.
4. Introduzir a sonda de temperatura cloacal para a tela a temperatura do corpo e monitorar a taxa de respiração, colocando um sensor pneumático debaixo da barriga do passarinho zebra. Feche o revestimento para conter o corpo do animal (Figura 3).
5. Manter a taxa de respiração dentro do intervalo de 40-100 ciclos por minuto e manter a temperatura corporal constante dentro de uma faixa estreita de 40 ± 0,5 ° C. Quando o intervalo para respirar é muito baixa / alta, ajustar o nível de anestesia (% isoflurano) em conformidade. Quando o problema persistir, o ensaio deve ser parado e o animal retirado da instalação, a fim de recuperar.
6. Posicione os alto-falantes dinâmicos não-magnéticos de cada lado da cabeça do passarinho zebra e congar-los para o amplificador. Certifique-se de que os fios dos alto-falantes são levados para longe da sonda de temperatura, pois pode influenciar a leitura da temperatura quando muito perto.
7. Coloque a bobina de superfície no topo da cabeça Finch zebra e a posição de zebra no centro do íman (e automaticamente o centro da bobina de transmissão, que está situado no meio do íman).
8. Reduzir o nível de anestesia para 1,5% de isoflurano misturado com o oxigênio e nitrogênio.

3. Aquisição de Dados

1. Adquirir um conjunto de 1 sagital, uma horizontal e uma imagem olheiro coronal gradiente-eco (GE) (sequence-piloto tri) e conjuntos de imagens multi-slice horizontal, coronal e sagital (T ₂ ponderada aquisição rápida de relaxamento avançada (pilotagem RARE) sequência SE) para determinar a posição do cérebro no íman (Figura 4).
2. Diminuir o ruído dos gradientes, aumentando os tempos de rampa para 1000 mS.
3. Prepare a sequência de fMRI: RARE T seqüência ₂ ponderada, eficaz TE: 60 ms, TR: 2000 ms, fato raro: 8, FOV: 16 mm, tamanho da matriz: 64 x 32, a orientação: sagital, espessura de corte: 0,75 mm, Inter-slice espessura de espaço: 0,05 milímetros, 15 fatias cobrindo quase todo o cérebro (Figura 4).
4. Selecione o protocolo auditiva (estímulos auditivos e tempo de entrega estímulo) no software de apresentação. Este protocolo consiste de uma seqüência de comandos - para o início de estímulos auditivos específicos - que são executadas em um número específico de digitalização. Em cada repetição na sequência fMRI, o software do scanner irá enviar um gatilho para o software de apresentação auditiva que por sua vez registra o número de varredura e executa o comando correspondente.
5. Para garantir que o software de apresentação auditiva não perder qualquer gatilho do leitor, o protocolo auditivo é iniciada em primeiro lugar. Uma vez que o protocolo é completamente carregado, a sequência de ressonância magnética é iniciado.
6. Cada experimento RMf é precedida pela aquisição de 12 imagens falsas para permitir que o sinal atribuído ao ruído scanner para alcançar um estado estável antes de iniciar a estimulação auditiva.
7. Após a aquisição de zero preencher os dados a 64 x 64.
8. Dê uma primeira olhada (preliminar) com os resultados utilizando a ferramenta funcional de paravisão (opção de processamento / Imagem Funcional). Calcule a resposta BOLD diferencial entre todos em blocos ea linha de base (OFF blocos). Esta análise dá uma primeira indicação da qualidade da experiência. Se nenhuma ativação é visto nas áreas auditivas primárias nesta fase, o pássaro provavelmente não ouviu / processados ​​os estímulos auditivos, devido a problemas técnicos com a apresentação do estímulo, o nível de anestesia, etc A instalação deverá ser verificada e medida repetida.
9. Executar uma seqüência T2 RARE 3D anatômica com a mesma orientação quanto aos exames de ressonância magnética anteriores e com TE eficaz: 60 ms, TR: 2000 ms, fato raro: 8, FOV: 16 mm, o tamanho da matriz: 256 x 128 x 64.
10. Zero-preencher os dados a 256 x 256 x 256.
11. Leve o tentilhão da cama MRI e deixá-lo recuperar da anestesia em uma gaiola sob uma lâmpada vermelha. Normalmente, a recuperação de uma Finch zebra após anestesia com isoflurano vai relativamente rápido (máximo 5 minutos). Depois de apenas alguns minutos, os pássaros vão tentar levantar-se e uma vez que a ave está totalmente recuperado, ele vai pousar em um ramo em vez de sentar no fundo da gaiola. A duração da anestesia é de cerca de 2 horas para o presente experimento. O tempo máximo de isoflurano anestesia aplicada a tentilhões-zebra em nosso laboratório é de 6 horas, após o que as aves também se recuperou dentro de 5 min.

4. Informática

1. Converta o MR-dados para analisar ou formato Nifti.
2. Porque SPM foi desenvolvido para processar os dados de ressonância magnética adquiridos nos seres humanos, isto é, para os voxels de cerca de 2 mm. Inúmeras definições SPM são adaptados a este tamanho aproximado voxel. Se a pessoa não faz wformiga para mudar todas as configurações, a maneira mais simples de proceder é aumentar artificialmente o tamanho do voxel dos dados de fMRI de aves. Ajuste o tamanho do voxel no cabeçalho multiplicando o tamanho real, voxel por 10 usando MRIcro. Deve notar-se, que este ajustamento não influencia os dados em si, não reamostragem ou quaisquer outras modificações que os dados são aplicados.

Uma alternativa para isso é o uso da 'SPMMouse ", que é um conjunto de ferramentas que permite SPM para abrir e analisar arquivos de qualquer dimensão do voxel. A ferramenta permite que os 'cérebros' SPM vidro a ser criado a partir de qualquer imagem, e ajusta automaticamente os padrões de escalas de comprimento com base nos cabeçalhos de arquivos de imagem ou dados introduzidos pelo utilizador. Assim, este toolbox funciona da maneira oposta do que aquilo que nos propomos. Em vez de mudar o tamanho do voxel das imagens para caber no SPM, as configurações padrão do SPM são alteradas para usar imagens com diferentes tamanhos de voxel.

3. Realinhar os dados de fMRI. Co-registrar o conjunto de dados 3D anatômico de tele séries temporais fMRI. Normalizar os dados em 3D (e da série co-registrada tempo fMRI) para o tentilhão cérebro MRI atlas. Aplicar a matriz de transformação para o conjunto de dados de fMRI. Isso tudo pode ser feito utilizando o Statistical Parametric Mapping (SPM) software 8.
4. Suavizar os dados com uma largura do kernel Gaussian 0,5 mm usando SPM8.
5. Realizar análises baseadas em voxel estatísticos utilizando SPM8. Modelo os dados como um carro de caixa (sem função resposta hemodinâmica). Estimar os parâmetros do modelo com o algoritmo da máxima verossimilhança restrita clássico. Calcular o efeito médio de cada estímulo auditivo em cada disciplina (análise de efeito fixo) e, em seguida, calcular estatísticas como desejava para análises de grupo (análise de efeito misto).
6. Projetar o mapa estatístico paramétrico para o tentilhão atlas (Figura 5) ⁹ em SPM8 para localizar as ativações funcionais (Figura 6).

Resultados

Nós aqui apresentada visualmente uma sequência otimizada de procedimentos para a imagem de sucesso de substratos neurais dos estímulos auditivos na finch cérebro zebra. Em primeiro lugar, o procedimento descrito para a preparação dos estímulos auditivos em resultados de estímulos que podem ser incorporados num ON / OFF paradigma bloco (Figura 2) e que são normalizados para eliminar possíveis diferenças no nível de pressão de som que pode evocar uma resposta diferencial no cérebro . Depois de prepa...

Discussão

Neste relatório, nós descrevemos um protocolo otimizado para o detalhado na caracterização vivo de substratos neurais da estimulação auditiva em tentilhões-zebra anestesiados.

Em consonância com o protocolo apresentado, a maioria dos estudos de ativação cerebral funcionais em animais utilizando fMRI BOLD, anestesiar os animais durante a aquisição. Treinar animais para acostumá-los ao ambiente ímã eo ruído do scanner durante os períodos de estudo também é possível, mas basta...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anestésico isoflurano	Isoflo	05260-05
Hardware/software PC-Sam	SA-Instruments		http://www.i4sa.com
Sistema de monitoramento e sincronização		1025
Sistema de aquecimento para roedores pequenos compatível com RM			Modelo 1025 compatível
Termômetro retal		RTP-102B	7'', 0,044''
Scanner de RM 7T	Bruker Biospin	PHS 70/16
Software Paravision		5.1
Gradiente inserido		BGA9S	400 mT/m, 300A, 500V
Amplificadores de gradiente	Copley Co., USA	C256
Ressoadores transmissores			Diâmetro interno: 72 mm, transmissão apenas, desacoplamento ativo
Antena receptora - Cabeça de camundongo quadratura 20 mm			Recepção apenas, desacoplamento ativo
Software WaveLab	Steinberg
Software Praat	Paul Boersma, University of Amsterdam		http://www.praat.org
Alto-falantes dinâmicos não magnéticos	Visation, Germany	HK 150
Microfone de fibra óptica	Optoacoustics,	Optimic 1160
Amplificador de som	Phonic corporation	MM 1002a
Software Presentation	Neurobehavioral Systems Inc.
MRIcro	Chris Rorden		http://www.cabiatl.com/mricro/mricro/
Mapeamento Paramétrico Estatístico (SPM)	Welcome Trust Centre for Neuroimaging	8	http://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm/