Summary
चूहे के मस्तिष्क से F1FO एटीपी synthase परिसरों में समृद्ध submitochondrial पुटिका अलग करने के लिए एक विधि का वर्णन किया है. इन vesicles F1FO ATPase जटिल और पैच दबाना रिकॉर्डिंग की तकनीक का उपयोग कर अपने मॉडुलन की गतिविधि के अध्ययन के लिए अनुमति देते हैं.
Abstract
माइटोकॉन्ड्रिया चयापचय, अस्तित्व 1, विकास और, कैल्शियम 2 संकेत सहित कई महत्वपूर्ण सेलुलर कार्यों में शामिल हैं. सबसे महत्वपूर्ण मितोचोन्द्रिअल कार्यों की दो एटीपी, oxidative phosphorylation के द्वारा सेल की ऊर्जा मुद्रा,, और क्रमादेशित कोशिका मृत्यु 3 के लिए संकेतों की मध्यस्थता के कुशल उत्पादन से संबंधित हैं.
एटीपी के उत्पादन के लिए मुख्य रूप से जिम्मेदार एंजाइम भी एटीपी synthase 4-5 बुलाया F1FO-एटीपी synthase, है. हाल के वर्षों में, apoptotic और परिगलित कोशिका मृत्यु में माइटोकॉन्ड्रिया की भूमिका काफी ध्यान दिया गया है. Apoptotic कोशिका मृत्यु में, इस तरह Bax रूप बीसीएल -2 परिवार प्रोटीन, mitochondrial बाहरी झिल्ली में प्रवेश oligomerize और साइटोसॉल 6 में समर्थक apoptotic कारकों को रिहा, बाहरी झिल्ली permeabilize. क्लासिक परिगलित कोशिका मृत्यु में, इस तरह के न्यूरॉन्स में ischemia या excitotoxicity, एक larg द्वारा उत्पादित के रूप मेंमैट्रिक्स कैल्शियम में ई, खराब विनियमित वृद्धि एक आंतरिक झिल्ली ताकना, mitochondrial पारगम्यता संक्रमण ताकना या MPTP का उद्घाटन करने के लिए योगदान देता है. यह भीतर की झिल्ली depolarizes और बाहरी झिल्ली टूटना, समर्थक apoptotic कारकों की रिहाई, और चयापचय रोग के लिए योगदान, आसमाटिक पारियों कारण बनता है. बीसीएल एक्सएल 7 सहित कई प्रोटीन F1FO एटीपी synthase, नियमन अपने कार्य के साथ बातचीत. बीसीएल एक्सएल F1FO एटीपी synthase बीटा सबयूनिट के साथ सीधे संपर्क रखता है, और इस बातचीत F1FO ATPase गतिविधि 8 के दौरान F1FO द्वारा एच + का शुद्ध परिवहन और जिससे बढ़ती मितोचोन्द्रिअल कार्यकुशलता बढ़ाने, F1FOATPasecomplex भीतर एक दरार चालकता कम हो जाती है. एटीपी synthase गतिविधि और मॉडुलन का अध्ययन करने के लिए, हम F1FO ATPase युक्त कृंतक मस्तिष्क submitochondrial पुटिकाओं (SMVs) से अलग किया. Alavian एट अल के रूप में दिखाया SMVs F1FO ATPase के संरचनात्मक और कार्यात्मक अखंडता बनाए रखने के लिए. यहाँ, हम एक विधि का वर्णनहम चूहे के मस्तिष्क से SMVs के अलगाव के लिए सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया है और हम SMVs की (आयन रिसाव प्रवाहकत्त्व) चैनल गतिविधि का विश्लेषण करने के लिए पैच दबाना तकनीक सीमांकित करते हैं.
Protocol
1. ब्रेन Mitochondrial अलगाव (ब्राउन एमआर एट अल से अनुकूलित. 9)
- संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित विधियों के प्रयोग चूहे बलिदान.
- कत्ल से पशु के सिर कट, त्वचा में कटौती और खोपड़ी बेनकाब.
- एक कैंची या rongeur साथ काटने से धीरे खोपड़ी खोलें. मस्तिष्क निकालें.
- अलगाव बफर में सेरिबैलम (1 टेबल देखें) के बिना सूक्ष्मता मस्तिष्क कीमा और एक 5 मिलीलीटर गिलास / Teflon homogenizer (उपकरणों की सूची देखें) को हस्तांतरण.
- ऊतक धीरे 10 बार (कोई बुलबुले), लगभग 5 मिनट homogenize.
- 4 में 10 मिनट डिग्री सेल्सियस एक बेंच शीर्ष अपकेंद्रित्र में के लिए 1500 × छ पर नमूना अपकेंद्रित्र.
- तैरनेवाला सहेजें (mitochondrial और synaptosomes) और गोली (परमाणु सामग्री और सेल मलबे) त्यागें. एक बेंच शीर्ष अपकेंद्रित्र में डिग्री सेल्सियस 4 में 10 मिनट के लिए 16,000 × छ पर अपकेंद्रित्र.
- छोड़नासतह पर तैरनेवाला और फिर से निलंबित अलगाव बफर के 500 μl में गोली. एक सेल व्यवधान पोत (उपकरणों की सूची देखें) के साथ synaptosomes बाधित. तेजी से decompression के द्वारा पीछा किया 10 मिनट के लिए 1,200 साई के दबाव लागू करें.
- 126500 पर परत Ficoll ढ़ाल पर मिश्रण (2 टेबल देखें), दप-50.1 रोटर और अपकेंद्रित्र में जगह × छ 4 बजे 20 मिनट के लिए ° ultracentrifuge एक में सी (उपकरणों की सूची देखें). गोली शुद्ध माइटोकांड्रिया है, Ficoll के विभिन्न घनत्व के बीच परत undisrupted synaptosomes है.
- 16,000 पर अलगाव बफर में centrifuging × छ 4 में 10 मिनट डिग्री सेल्सियस के लिए एक बेंच शीर्ष अपकेंद्रित्र में से गोली धो लें.
2. Submitochondrial Vesicles (SMV) अलगाव (चान एट अल. 10 से अनुकूलित)
- 1% digitonin के एक बराबर मात्रा के साथ संयुक्त 200 μl अलगाव बफर में माइटोकॉन्ड्रिया पुनः निलंबित और 15 मिनट के लिए बर्फ पर बैठने के लिए अनुमति देते हैं.
- अधिक अलगाव शौकीन जोड़ें16,000 पर एर और अपकेंद्रित्र × 4 बजे 10 मिनट के लिए छ ° एक बेंच शीर्ष अपकेंद्रित्र में सी. दो बार करो.
- 200 μl अलगाव बफर में गोली पुनः निलंबित और 10% Lubrol px के (C12E9) के 2 μl जोड़ें. मिश्रण को 15 मिनट के लिए बर्फ पर बैठने के लिए अनुमति देते हैं.
- 182000 पर अलगाव बफर, दप-50.1 रोटर में जगह और अपकेंद्रित्र पर परत मिश्रण × 4 में छ ° 1 घंटे के लिए सी.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 16,000 पर अलगाव बफर में एक डेस्क टॉप अपकेंद्रित्र × छ में centrifuging द्वारा अंतिम गोली धो लें
3. Electrophysiological रिकॉर्डिंग
- एक ठेठ इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिग एक एम्पलीफायर, pClamp10.0 सॉफ्टवेयर, manipulators, एक माइक्रोस्कोप, एक कंपन अलगाव मेज, फैराडे पिंजरे के साथ संयोजन के रूप में एक Digidata 1440A एनालॉग से डिजिटल कनवर्टर इंटरफ़ेस से लैस एक पीसी कंप्यूटर शामिल हैं.
- Borosilicate ग्लास केशिका ट्यूब एक ज्वलंत / ब्राउन micropipette डांड़ी मॉडल P-87 में डाला जाता है. एक विंदुक खींचने कार्यक्रम के लिए अनुकूलित हैMΩ 80 से 100 के बीच resistances के साथ pipettes उत्पन्न करते हैं.
- SMVs एक शारीरिक intracellular समाधान (एटीपी रिकॉर्डिंग के दौरान उचित समय पर जोड़ा जाता है) (3 टेबल) में रखा जाता है. पैच दबाना pipettes का एक ही समाधान (कोई एटीपी) के साथ भर रहे हैं. रिकॉर्डिंग कमरे के तापमान पर SMVs पर एक giga ओम मुहर बनाने से बनते हैं. Vesicles एक Nikon या जीस उलटा माइक्रोस्कोप के साथ चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना कर रहे हैं.
- झिल्ली क्षमता -100 एम वी से 10 सेकंड की अवधि के लिए + 100 एमवी को लेकर वोल्टेज पर बनाए रखा है. रिकॉर्डिंग एम्पलीफायर circuitry का उपयोग 5 kHz पर छान रहे हैं. कम से कम 1 पीए की आवारा बिजली या गैर विशिष्ट शोर का स्तर सफल रिकॉर्डिंग के लिए वांछित हैं.
- डाटा आवृत्ति और एक चैनल घटनाओं के आयाम को निर्धारित करने के लिए उदाहरण के लिए Clampfit 10.0 सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण कर रहे हैं. वोल्टेज निर्भरता एक वर्तमान वोल्टेज रिश्ते की साजिश रचने के द्वारा निर्धारित किया जाता है.
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Representative Results
हमारे प्रोटोकॉल का पहला कदम चित्रा 1 में वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा दिखाया के रूप में माइटोकॉन्ड्रिया शुद्ध के अलगाव के लिए अनुमति देता है. चित्रा 2 में एक मस्तिष्क व्युत्पन्न submitochondrial पुटिका पैच रिकॉर्डिंग का एक उदाहरण दिखाया गया है. अंदर बाहर पैच विन्यास का उपयोग हम एटीपी द्वारा संग्राहक चैनल गतिविधि प्रदर्शित करता है. नियंत्रण (सीटीएल) रिकॉर्डिंग (बाएं) औसतन 600 पीएस की एक चोटी चालकता के साथ बहु - प्रवाहकत्त्व चैनल गतिविधि को दर्शाता है. कि तुरंत स्नान करने एटीपी 1 मिमी के अलावा पर कम था. एटीपी के समग्र प्रभाव एक एकाग्रता पर निर्भर ढंग SMVs पैच की चालकता में कमी की है. SMV-अपवर्जित एच + सूचक ACMA के प्रतिदीप्ति तीव्रता में कमी को मापने, 3 चित्र में दिखाया गया है F1FO ATPase के क्षमता को मापने के अलगाव के बाद, हम एटीपी हाइड्रोलिसिस के जवाब में SMVs में एच + आयनों के आंदोलन को मापा. एटीपी संवेदनशील एच + SMVs में आयन ज़ब्ती जोड़ने के बाद बढ़ाया हैएटीपी की ition. यह परख एच + आयन ज़ब्ती की क्षमता को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. कम कुशल SMVs + आयनों अधिक धीरे या एक छोटे शिखर मूल्य के लिए एच जमा करेंगे. उदाहरण के लिए एच + आयन ज़ब्ती बीसीएल एक्सएल inhibitors और FCCP (Alavian एट अल., 2011) के अलावा द्वारा तनु है.
| अंतिम एकाग्रता | |
| इक्षुशर्करा | 250 मम |
| Hepes | 20 मम |
| ईडीटीए | 1 मम |
| बीएसए | 0.5% |
तालिका 1. अलगाव बफर.
| Ficoll | 22 मिलीलीटर 20%> |
| इक्षुशर्करा | 12 मिलीलीटर 1 एम |
| ईडीटीए | 18.75 μl 0.1 एम |
| Tris-एचसीएल | 375 μl 1 एम (7.4 पीएच) |
| टॉप लेयर Ficoll के 7.5% | |
| Ficoll शेयर | 10 मिलीलीटर |
| अलगाव बफर | 6 मिलीग्राम |
| Ficoll के नीचे की परत 10% | |
| Ficoll शेयर | 15.5 मिलीलीटर |
| अलगाव बफर | 2.5 मिलीलीटर |
तालिका 2. Ficoll स्टॉक.
| KCl | 120 मिमी |
| NaCl | 8 मिमी |
| EGTA | 0.5 मिमी |
| Hepes | 10 मिमी |
| पीएच | 7.3 |
तालिका 3. आंतरिक Soluमोर्चे.
चित्रा 1. Lysate के प्रतिनिधि immunoblot cytosol और mitochondria से शुद्ध. ऊपरी पैनल साइटोसोलिक प्रोटीन GAPDH के खिलाफ एक एंटीबॉडी का उपयोग कर एक immunoblot से पता चलता है. नीचे पैनल मितोचोन्द्रिअल innner झिल्ली प्रोटीन CoxIV के खिलाफ एक एंटीबॉडी का उपयोग कर एक immunoblot से पता चलता है.
चित्रा 2. 1 मिमी एटीपी के अलावा के पहले और बाद में दो प्रतिनिधि पैच दबाना रिकॉर्डिंग. संभावित होल्डिंग 70 एम वी है. धराशायी लाइन 0 पीए का प्रतिनिधित्व करता है. प्रत्येक ट्रेस 10 सेकंड के लिए दर्ज की गई और निशान के बीच 10 सेकंड नहीं है.
चित्रा 3. के प्रतिदीप्ति तीव्रता परिवर्तन का उदाहरण निशानSMVs की उपस्थिति में और एटीपी की अनुपस्थिति (काला ट्रेस) और उपस्थिति (लाल ट्रेस) में समय के साथ ACMA सूचक.
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Discussion
तरीकों में दिखाया के रूप में इस के साथ साथ इस विधि द्वारा phenotypes.SMVspurified सेल के भेदभाव के बिना पूरे दिमाग से चरण 2 के बाद चरण 1 और submitochondrial पुटिकाओं (SMVs) के अंत में अन्य subcellular organelles के द्वारा संदूषण का अनिवार्य रूप से मुक्त शुद्ध mitochondria के अलगाव को सक्षम वर्णित चित्रा 1 और हमारे पिछले काम (Alavian के.एन. एट अल. 8) और पूर्व ठंड के लिए उनकी संरचनात्मक और कार्यात्मक अखंडता बनाए रखने के लिए. ठंड और विगलन के बाद, माइटोकॉन्ड्रिया पृथक या SMVs रिकॉर्डिंग और जैव रासायनिक assays के लिए उपयोग किया जाता है, लेकिन नहीं सांस की पढ़ाई के लिए.
इस विधि इसके अलावा एक ही चरणों का उपयोग जिगर से माइटोकॉन्ड्रिया अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. माइटोकांड्रिया और SMVs electrophysiological रिकॉर्डिंग के चेंबर में चढ़ाया जब समूहों के रूप में करते हैं, ध्यान एक अत्यधिक clumping को या अत्यधिक कमजोर पड़ने के रूप में, नमूना लोड करने के लिए दी जानी चाहिए possibili कम हो सकती हैसील गठन के ty. इसके अलावा, ध्यान अलगाव शुरू करने से पहले कई तकनीकी जानकारी दी जानी चाहिए. यह साफ उपकरणों का उपयोग करने के लिए और बर्फ पर उन्हें रखने के लिए महत्वपूर्ण है. सभी प्रक्रियाओं बर्फ पर प्रदर्शन किया और सभी सेंट्रीफ्यूज 4 डिग्री सेल्सियस पर सेट किया जाना चाहिए Ficoll ढाल की तैयारी ठीक से एक सफल प्रयोग के लिए महत्वपूर्ण है. Ficoll के दो सांद्रता के बीच एक सही जुदाई बनाना subcellular अंशों की पवित्रता को बढ़ाती है.
इस तकनीक की एक सीमा है कि एक विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्र से नमूना सब्सटैंशिया निग्रा पार्स कॉम्पेक्टा या striatum से माइटोकॉन्ड्रिया उदाहरण के लिए वांछित है अगर छोटा हो सकता है जो प्रोटीन की अंतिम राशि से लगाया जाता है. कई जानवरों से नमूने पूलिंग काटा प्रोटीन की कुल राशि को बढ़ाने के लिए आवश्यक हो सकता है.
माइटोकांड्रिया या SMVs 1 मिलीग्राम / एमएल में aliquoted और -80 में जमा हो जाती है डिग्री सेल्सियस और वे कई महीनों के लिए रिकॉर्डिंग के लिए स्थिर रहे हैं, तथापि, यह preferabl हैई विगलन के बाद मितोचोन्द्रिअल नमूना फिर से फ्रीज करने के लिए नहीं. इस विधि द्वारा शुद्ध vesicles ऐसे पैच दबाना रिकॉर्डिंग के रूप में अलग अलग दृष्टिकोण, जैव रासायनिक तकनीकों और अन्य कार्यात्मक अध्ययन का उपयोग, एटीपी synthase अध्ययन करने के लिए उपयोगी होते हैं. इस तैयारी के साथ एक ड्रग्स या F1FO ATPase गतिविधि और संरचना पर छोटे अणुओं के प्रभाव का विश्लेषण कर सकते हैं.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potter-Elvehjem Tissue Grinder withPTFEPestle | Krackeler Scientific, Inc. | 1-7725T-5 | |
| Eppendorf Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5424 000.410 | |
| 4639 Cell Disruption Vessel | Parr Instrument Company | 4639 | |
| Ficoll | Sigma-Aldrich | F5415 | |
| Polycarbonate centrifuge tubes | Beckman Coulter | P20314 | |
| SW-50.1 rotor | Beckman Coulter | ||
| L8-70M Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D5628 | |
| Lubrol PX (C12E9) | Calbiochem | 205534 | |
| Axopatch 200B | Axon Instruments | ||
| Digidata 1440A | Molecular Device | ||
| pClamp10.0 | Molecular Device | ||
| Manipulator | Sutter Instrument | ||
| Borosilicate glass capillary | World Precision Instruments | 1308325 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller Model P-87 | Sutter Instrument |
References
- Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F., Hardwick, J. M. Mitochondrial factors with dual roles in death and survival. Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).
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