Citometria de massa: Protocolo para Ajuste Diário e amostras de células em execução em um citômetro de Massa CyTOF

Resumo

Os passos necessários para a sintonização diária e optimização do desempenho de um citómetro de massa CyTOF são descritos. Comentários sobre a preparação da amostra ideal e vazão são discutidos

Resumo

Nos últimos anos, a análise rápida de células individuais tem sido normalmente realizadas utilizando a citometria de fluxo por fluorescência e anticorpos marcados. No entanto, a questão da sobreposição espectral de emissões fluoróforo tem limitado o número de sondas simultâneas. Em contraste, o citómetro de nova massa CyTOF por casais DVS Sciences um sistema de introdução de líquido de uma única célula de um ICP-MS. ^Uma vez de fluoróforos, os polímeros de quelação que contenham os isótopos de metal altamente enriquecidas são acopladas a anticorpos ou outras sondas específicas. ^2-5 Devido à pureza do metal e resolução de massa do citómetro de massa, não existe nenhum "sobreposição espectral" de isótopos vizinhos, e, portanto, não há necessidade de matrizes de compensação. Além disso, devido ao uso de metais lantanídeos, não há biológico e, por conseguinte, qualquer equivalente de autofluorescência. Com uma janela de massa estendida massa atómica 103-203, teoricamente até 100 etiquetas podem ser distinguidos simultaneamente. Atualmente, Mais de 35 canais estão disponíveis usando os reagentes quelante disponível a partir de DVS Sciences, permitindo a dissecção sem precedentes do perfil imunológico de amostras. ^6-7

Desvantagens para citometria de massa incluem o requisito estrito para um isótopo de metal separado por sonda (nenhum equivalente de dispersão frontal ou lateral), e o facto de que é uma técnica destrutiva (sem possibilidade de separação de recuperação). A actual configuração do citómetro de massa também tem uma taxa de transmissão de células de apenas ~ 25%, o que requer um maior número de células de entrada.

Desempenho diário ideal do citômetro de massa requer várias etapas. O objectivo básico da optimização é maximizar a intensidade de sinal de medição dos isótopos de metal desejados (M) ao mesmo tempo minimizando a formação de óxidos (M 16), que irá diminuir a intensidade do sinal M e interferir com qualquer sinal desejado em M 16. O primeiro passo é aquecer a máquina para um quente, eu estávelCP plasma foi estabelecida. Segundo, as definições para a taxa atual e make-up de fluxo de gás deve ser otimizada em uma base diária. Durante a recolha de amostra, a taxa máxima de células evento é limitada pela eficiência do detector e a velocidade de processamento de 1000 células / segundo. No entanto, dependendo da qualidade da amostra, uma taxa mais lenta do evento de células (300-500 células / segundo), é usualmente desejável para permitir uma melhor resolução entre os eventos de células e, assim, maximizar singlets intactas sobre doublets e detritos. Por fim, a limpeza adequada da máquina no fim do dia, ajuda a minimizar o sinal de fundo, devido ao metal livre.

Protocolo

Todas as amostras de células para a CyTOF devem ser fixadas e permeabilizadas. Isto permite uma maior entrada do intercalador de ADN contendo irídio, e também evita que a lise das células durante a lavagem com água MilliQ e ressuspensão passos imediatamente antes de proceder à injecção no citómetro de massa.

1. Start-up da Citómetro Massa

1. Abra o programa de software CyTOF. Selecione Configuração do instrumento. Na guia do gabinete, ir para o canto inferior direito e clique aquecedor "ON" botão. Ligar o aquecedor, pelo menos, 15 min antes do momento desejado para permitir tempo suficiente para que o manto da câmara de pulverizaç....

Resultados

Seguindo o protocolo acima deve realizar quatro coisas. Em primeiro lugar, permitindo que o tempo de aquecimento adequado para o citômetro de massa irá produzir um plasma quente e estável necessário para o sinal ótima e formação de óxido mínimo. Lavagem, segundo adequada do citómetro de massa com MilliQ água e solução de lavagem DVS (Figura 9) vai ajudar a reduzir os níveis de metal de adsorção para a tubagem e outras partes da máquina, ajudando a reduzir o fundo durante a aquisição de amostras .......

Discussão

Para as últimas décadas, a citometria de fluxo de fluorescência tem sido um método laborioso para a análise de células individuais, quer em termos de expressão de superfície e em ensaios funcionais. No entanto, os problemas de sobreposição espectral dos corantes fluorescentes tem limitado o número de marcadores em simultâneo. Embora experimentos com mais de 12 marcadores simultâneos têm sido relatados, o montante da compensação necessária torna esta tecnicamente difícil.

Em vez de fluoróforo.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
CyTOF TM massa citómetro	DVS Ciências
Lave solução	DVS Ciências	201071	0,05% de ácido fluorídrico em água
Ajustando solução	DVS Ciências	201072	0,5 ppm La, Cs, Tb, Tm, Ir, traço de ácido nítrico
Ue contêm esferas de poliestireno	DVS Ciências	201073	Contém isótopos naturais abundância UE; contas fornecidos em aproximadamente 1 milhão / mL
Multi-lantanídeos contendo (La / Pr / Tb / TM / Lu) - esferas de poliestireno	DVS Ciências	Ainda não disponível comercialmente	Contém natural abundância de isótopos de lantanídeos listadas
Ácido nítrico (concentrado)	Fisher Scientific	A467-500	Optima-trace metal puro ICP-MS grau
Tubo de fundo redondo de poliestireno com células coador-cap-5ml	BD	352235	usado para filtrar amostras de células antes da injecção
Norm-Ject tuberkulin seringa-1mL	Henke Sass Lobo	4010-200V0	sem silicone, sem látex
Norm-Ject-seringa de 3 mL	Henke Sass Lobo	4010.000V0	sem silicone, sem látex
Água MilliQ			18 MQ água pura, não deve ser armazenado em garrafas de vidro ou de plástico que foram lavados com detergente comercial (devido a seus altos níveis de presente de bário).
Citranox	Sigma-Aldrich	Z273236	detergente ácido
O gás argônio	Praxair	AR 5.0UH-T	99,999% de pureza ultra-elevada