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1. Sangue Total
- Coletar sangue total de doadores voluntários em 450 ml coleção topo / fundo define de acordo com a diretrizes de coleta de sangue locais.
- O sangue total é armazenado durante um período mínimo de 2 horas em uma placa de arrefecimento antes da centrifugação e separação.
2. Buffy Preparação Brasão
- Centrifuga-se o sangue total utilizando uma rotação difícil separar o sangue em três camadas: as células vermelhas do sangue, buffy coat e plasma. Parâmetros de centrífuga foram utilizados 4880 RCF durante 11 minutos à temperatura de 22 ± 2 ° C.
- Utilizar um separador de sangue automatizado para expressar o plasma para dentro do saco de satélite superior e as células vermelhas do sangue (RBC) na bolsa de satélite inferior, deixando a cobertura amarelada no recipiente de recolha. Alvo significam as faixas de volume e hematócrito para casacos buffy são aproximadamente 48 ml e 37%, respectivamente.
- Os buffy-revestimentos são armazenadas durante a noite num agitador de plaquetas a 22 ± 2 ° C.
- Estéril de conexão 7 flogística e 300 ml de solução de aditivo SSP + plaquetas (PAS), em uma configuração comboio com linhas paralelas para reduzir o comprimento do comboio, o PAS deve estar no topo do trem. Prenda a linha entre o PAS eo revestimento buffy primeiro.
- Abrir as ligações entre as unidades estéreis buffy coat e permitir que o revestimento buffy escorrer para o recipiente anterior.
- Abrir a solda e o grampo entre a PAS e a crosta inflamatória primeiro. Permitir que um terço da solução de aditivo de lavar por meio de cada um dos recipientes de camada leuco-plaquetária sequencialmente. Repita duas vezes mais de cada vez utilizando metade da PAS restante.
- A média buffy coat volume da piscina deve ser aproximadamente 600 ml. Se o volume do alvo e do hematócrito dos revestimentos individuais buffy forem satisfeitas, o rácio de plasma será de 32 - 47%, conforme necessário para o tratamento de inactivação INTERCEPT patógeno mais tarde no processo.
- Descarte o vazio SSP + e buffyrecipientes casaco.
- Para a recuperação de plaquetas ideal, mantenha a piscina do agitador durante 1 hora antes da centrifugação.
- Estéril ligar um recipiente de armazenagem de plaquetas com filtro leucorredução integrada para a piscina buffy coat.
- Executar um "spin suave" do conjunto de buffy coat para separar as células vermelhas do sangue a partir das plaquetas na suspensão (462 RCF durante 9 min, 20 seg.) Expressar a suspensão de plaquetas usando um separador de sangue automatizado através do filtro leucorredução no recipiente de armazenagem de plaquetas.
- Os requisitos de processamento descritas anteriormente assegurar que a suspensão de plaquetas satisfaz as especificações de processamento INTERCEPT de 300 ml - 420 ml de volume, 2,5-7,0 x 10 11 dose de plaquetas, e ≤ a 4 x 10 6 / ml de glóbulos vermelhos.
4. INTERCEPTAR Tratamento
- Realizar o tratamento INTERCEPT antes do final do 1 º dia após a coleta (dia 0 é o dia da coleta).
- Desembrulhe o Conjunto de Processamento INTERCEPTcom recipientes de armazenamento dupla da bolsa de plástico transparente.
- Conectar o recipiente estéril suspensão de plaquetas aos tubos do recipiente amotosalen sobre o conjunto de processamento INTERCEPT.
- Rotular a interceptação de processamento de recipientes de armazenamento conjunto com a identificação adequada de sangue produto seguindo as exigências locais.
- Pendurar as plaquetas e quebrar primeiro a cânula inferior no recipiente amotosalen, permitindo que a solução amotosalen flua para o recipiente de iluminação. Quebrar a cânula de topo no recipiente amotosalen permitindo que as plaquetas a fluir através do recipiente para o recipiente amotosalen iluminação.
- Misturar cuidadosamente a mistura de plaquetas e amotosalen e expressar o ar a partir do recipiente para o recipiente de iluminação amotosalen.
- Expressam uma pequena quantidade da mistura de plaquetas à tubagem, enchendo cerca de 4 cm da tubagem. Isto assegura plaquetas em ambos os tubos e submeter-se ao recipiente de iluminação inactivati patógenoem tratamento.
- Selar o tubo entre o recipiente de iluminação e do recipiente amotosalen. Deixar não mais do que cerca de 4 cm de tubo que se prolongam a partir do recipiente de iluminação. Retire e descarte a plaquetas e recipientes vazios amotosalen e fechar os grampos nas bolsas de amostragem.
- Colocar o conjunto de processamento para o iluminador com o recipiente de iluminação no compartimento grande no lado esquerdo e do organizador no compartimento mais pequeno, no lado direito.
- Use o dispositivo de código de barras de mão para inserir a ID doação, código do produto, número de lote e processamento conjunto para o iluminador. Feche a tampa de metal e, quando solicitado na interface gráfica iluminador, fechar a gaveta. Pressione o botão "Iniciar" para iniciar a Iluminação.
- Depois de iluminação, retirar o conjunto de processamento a partir do iluminador. O iluminador imprime automaticamente o relatório para a unidade de tratamento tratados com plaquetas (s).
- Desembrulhar os recipientes do organizador e pendurar a platelets e conjunto de processamento, quebrar a cânula na saída do recipiente de iluminação, e permitir que as plaquetas a fluir para dentro do dispositivo composto de adsorção (CAD) do recipiente.
- Tomando cuidado para não dobrar o wafer CAD, expressar o ar a partir do recipiente para o recipiente CAD iluminação utilizando um extractor de plasma.
- Selar o tubo, próximo da abertura de entrada do recipiente de CAD. Retire e descarte o recipiente vazio iluminação.
- Colocar o recipiente de CAD com os recipientes de armazenamento conectados em um agitador de plaquetas, pelo menos, 6 horas, mas não mais de 16 horas. Isto irá resultar na redução da amotosalen residual a uma concentração de ≤ 2 uM.
- Após o tratamento da DAC, remover as unidades de plaquetas a partir do agitador. Pendure as plaquetas. Quebrar a cânula e permitir que as plaquetas a fluir para os recipientes de armazenamento.
- Exprime-se o ar a partir dos recipientes de armazenamento para o recipiente de CAD. Deixe que a parte de trás do fluxo residual concentrado de plaquetas nos recipientes de armazenamento,gravidade. Selar o tubo acima da Y-encaixe e remova o recipiente vazio CAD.
- Volume de redistribuir entre os recipientes de armazenamento, conforme necessário. Os ajustes de volume são feitas através da pesagem dos recipientes de armazenamento. Selar o tubo em cada recipiente de armazenamento de alguns centímetros acima da entrada do recipiente de armazenamento, o que facilita a obtenção de uma amostra estéril do produto final, tal como descrito em 5.2.
5. Amostragem produto
- Para os testes de rotina QC, os recipientes de armazenamento final pode ser amostrada uma vez, utilizando o saco de amostragem nos recipientes de armazenamento. Para fazer isso, assegurar que a unidade de plaquetas é bem misturada e, em seguida abrir o grampo para a bolsa e apertar várias vezes. Selar o tubo após a bolsa ter enchido com as plaquetas. Transfira a amostra das plaquetas para um tubo de laboratório adequado e realizar ensaios de imediato.
- Para obter amostras em múltiplos pontos temporais ao longo de armazenamento, tal como um estudo de validação, conectar estérilum recipiente de amostragem de novo para o tubo do recipiente de armazenagem de plaquetas. Certifique-se de que as plaquetas são bem misturados antes de serem transferidos para o recipiente de recolha.
6. Avaliação in vitro da função
- Para este estudo de validação, a avaliação in vitro foi realizada após CAD tratamento (Dia 1 ou Dia 2, dependendo da duração CAD) e novamente no Dia 4 (ou 5 º dia) e no dia 7. Em medições in vitro incluiu volume, a contagem de plaquetas, pH, gás de sangue (PO 2, PCO 2), glicose, lactato, e rodando.
- O volume foi determinado pelo peso, utilizando 1,01 g / ml, tal como a gravidade específica de plaquetas na solução de aditivo.
- Contaminação da hemoglobina foi avaliado visualmente por comparação com uma escala de cores.
- Roda foi determinada visualmente.
- Consulte "Tabela de equipamentos" para a metodologia de outros ensaios.
7. Resultados representativos
O processo de produção de double dose de buffy coat plaquetas inicia-se com a produção de revestimentos individuais buffy que satisfazem as especificações de destino para o volume e o hematócrito. Como não é prático para medir o hematócrito do indivíduo flogística durante o processo de validação final, começou a realizar um esforço separado para otimizar a nossa buffy casacos para garantir que poderiam atender de forma consistente volume alvo e hematócrito. Como mostrado na Tabela 1, os casacos optimizado buffy comparados favoravelmente com os valores alvo para o volume e hematócrito a 46 ± 2 mL e 37 ± 3%, respectivamente.
Depois de partilha, o volume do hematócrito e da piscina buffy coat deve ser de aproximadamente 600 ml e 20%, respectivamente, antes da centrifugação, rotação suave. Como ilustrado na Tabela 2, os conjuntos de buffy coat em média 615 ± 5 ml, o hematócrito em média de 19 ± 1%.
Os resultados de spin suaves centrifugação em um conc dose dupla de plaquetasEntrate que preencham os requisitos de entrada para a inativação de patógenos que utilizam o Sistema de Sangue INTERCEPT DS conjunto de processamento. Parâmetros de entrada chave para o tratamento INTERCEPT incluem contagem, volume de plaquetas, plasma relação e conteúdo RBC. Além disso, pretende-se recuperar ≥ 75% das plaquetas no concentrado de plaquetas, em comparação com o pool de buffy coat. Por exigências locais, a contaminação de glóbulos brancos (WBC) deve ser <1x10 6 / unidade. O concentrado de plaquetas na nossa validação preencheram os parâmetros chave para o tratamento INTERCEPT, bem como os alvos de WBC contaminação e recuperação das plaquetas, como mostrado na Tabela 3.
O processo de inactivação de agentes patogénicos INTERCEPT é executada no concentrado de dose dupla de plaquetas utilizando um conjunto único de processamento INTERCEPT. O conjunto de processamento contém dois recipientes de armazenamento integrado que permitem que a unidade tratada para ser dividida em duas doses individuais terapêuticas de plaquetas após a conclusão do caminhoOgen processo de inativação. Orientações europeias exigem que 75% das unidades testadas contêm ≥ 200x10 9 plaquetas por terapêutica dose1; requisitos locais na Suécia exigem que 75% das unidades testadas contêm> 240x10 9 plaquetas por dose. Após o tratamento INTERCEPT, o teor médio de plaquetas foi de 265 ± 22 x10 9 (n = 24). Além disso, 88% das unidades alcançado ou ultrapassado 240x10 9 plaquetas por dose terapêutica, o que está bem dentro de ambas as diretrizes e regulamentos europeus suecos. Veja as Figuras 1 e 2 para uma ilustração da dupla preparação casaco dose de Buffy e processos INTERCEPT tratamento, respectivamente.
Para esta validação, medimos o em características in vitro do concentrado de plaquetas após o tratamento INTERCEPT (isto é, após a separação entre os recipientes de armazenamento individuais); parâmetros foram medidos ao longo de 7 dias de armazenamento. A média eo desvio-padrão foram coletadas paradosagem de plaquetas, pH, PO 2, PCO 2, a produção de lactato e consumo de glicose.
A Figura 3 mostra a média de uma dose inicial de plaquetas do concentrado de plaquetas dose dupla antes do tratamento INTERCEPT e a dose média de plaquetas em cada um dos produtos da divisão após tratamento INTERCEPT ao longo de 7 dias de armazenamento. Perda de plaquetas durante a armazenagem foi de aproximadamente 9%. Essa redução não é diferente da esperada perda de plaquetas durante a armazenagem de plaquetas convencionais. 2
A Tabela 4 resume as características in vitro em plaquetas dos INTERCEPT após o tratamento e dividindo-se em unidades individuais.
Por requisitos europeus, o pH de plaquetas deve ser superior a 6,4 através do fim da vida útil de prateleira. Durante o processamento, o pH do concentrado de plaquetas cai um pouco dependendo da concentração de plaquetas, volume, e a permeabilidade ao gás do sto plaquetáriarecipiente raiva. Figura 4 ilustra o pH dos produtos da divisão de plaquetas ao longo de 7 dias de armazenamento. Durante o armazenamento, o pH é mantido estável e bem dentro das exigências de processamento.
Como mostrado nas Figuras 5A e 5B, o consumo de O2 de plaquetas e produção de CO 2 indicam a respiração continuada pelas plaquetas intercepto no recipiente PL2410 durante 7 dias de armazenamento. Figuras 6A e 6B mostram os níveis de lactato e de glucose, ao longo de 7 dias de armazenamento . O consumo de glucose e produção de lactato de plaquetas são consistentes com o outro, durante os 7 dias de armazenamento. 5 unidades tinham níveis de glicose inferior a 1,11 mmol / l (o limite inferior para o doseamento de glucose).
A preparação buffy coat e plaquetas validação agrupamento produzido concentrados que preencheram os critérios de entrada para tratamento INTERCEPT, especificamente, volume, contagem de plaquetas, plasma relação, e vermelho blood contaminação celular. As unidades finais preencheram os critérios de validação ao longo de 7 dias de armazenamento, incluindo a dose de plaquetas e pH.
| Parâmetro | Target Range | Resultados A média ± DP |
| Volume (ml) | ~ 48 | 46 ± 2 |
| Hematócrito (%) | ~ 37 | 37 ± 3 |
| Tempo de espera antes de partilha | Pernoite em agitador | Pernoite em agitador |
Tabela 1. Características do indivíduo Buffy Coats (n = 19).
| Parâmetro | Target Range | Resultados A média ± DP |
| Volume (ml) | ~ 600 | 615 ± 5 |
| Hematocrit (%) | ~ 20 | 19 ± 1 |
| Tempo de espera antes da centrifugação | 1 hora em agitador | 1 hora em agitador |
Tabela 2. Características das Piscinas Buffy Coat (n = 12).
| Parâmetro | Alvo | Resultados A média ± DP |
| Volume (ml) | 370-420 | 404 ± 8 |
| A contagem de plaquetas (x10 9 / unidade) | 250-700 | 577 ± 62 |
| A média de recuperação de plaquetas (%) | ≥ 75 | 75 ± 4 |
| Plasma proporção (%) | 32-47 | 38 ± 1 |
| RBC (x10 6 / ml) | ≤ 4 | 1,2 ± 0,4 |
| WBC (x10 6 | ≤ 1 | 0,11 ± 0,1 |
| Tempo de espera antes da Interceptação (hr) | ≤ final do dia 1 | ≤ final do dia 1 |
Tabela 3. Características da Plaquetas Double-Dose Concentrados (n = 12).
| Média ± DP | Min | Max |
| Volume (ml) | 199 ± 16 | 182 | 236 |
| A contagem de plaquetas (x10 9 / unidade) | 265 ± 22 | 225 | 292 |
| pH (22 ° C) | 6,9 ± 0,1 | 6,8 | 7 |
| pO 2 (kPa) | 21,4 ± 4,8 | 12,8 | 27,3 |
| pCO 2 (kPa) | 4,3 e plusmn, 0,4 | 3,3 | 4,9 |
| De lactato (mmol / l) | 9,1 ± 1,7 | 6,8 | 12,4 |
| Glucose (mmol / l) | 5,3 ± 0,9 | 3,7 | 6,5 |
Tabela 4. Características do INTERCEPT Dia plaquetas tratadas 1/2 (em unidades individuais, n = 24).

Figura 1. Produção de um concentrado duas vezes a dose de plaquetas a partir de um pool de 7 flogística.

Figura 2. Inativação de patógenos de um concentrado de plaquetas dose dupla com o Sistema de Sangue INTERCEPT.

Figura 3. A dose média de plaquetas antes e durante7 dias após o tratamento INTERCEPT (n = 12 antes INTERCEPT, n = 24 depois INTERCEPT).

Figura 4. A média ± DP de pH de plaquetas após INTERCEPT tratamento (n = 24).

Figura 5A. Média ± SD pO 2 INTERCEPT após tratamento (n = 24).

Figura 5B. Média ± SD pO 2 INTERCEPT após tratamento (n = 24).

Figura 6a. Níveis médios de lactato ± DP depois da interceptação de tratamento (n = 24).

Figura 6B. Os níveis médios de glicose ± SD após o tratamento INTERCEPT (n = 24).