Quantitativa FRET (Förster Resonance Energy Transfer) Análise para SENP1 Determinação Cinética Protease

Resumo

Um novo método que envolve a análise quantitativa de FRET (Förster Resonance Energy Transfer) sinais é descrito para o estudo de cinética enzimática. K _{M E K Gato Foram obtidos por hidrólise do domínio catalítico de SENP1 (SUMO / Sentrin protease específica 1) para pré-SUMO1 (modificador ubiquitina-like Pequeno). Os princípios gerais deste estudo cinético quantitativo-FRET baseada protease pode ser aplicado a outras proteases.}

Resumo

Reversíveis modificações pós-tradução de proteínas com proteínas ubiquitina ou ubiquitina-like (Ubls) são amplamente usados ​​para regular a actividade da proteína de forma dinâmica e têm diversos papéis em diversos processos biológicos. Por exemplo, SUMO covalentemente modifica um grande número de proteínas ou com papéis importantes em muitos processos celulares, incluindo a regulação do ciclo celular, sobrevivência e morte celular, resposta a danos no ADN, e resposta ao estresse 1-5. SENP, como SUMO-protease específico, funciona como uma endopeptidase na maturação dos precursores SUMO ou como uma isopeptidase para remover SUMO de proteínas-alvo e refrescar o ciclo SUMOilação ^1,3,6,7.

A eficiência catalítica ou especificidade de uma enzima é melhor caracterizada por a razão entre as constantes cinéticas, k _cat / K _M. Em diversos estudos, os parâmetros cinéticos da SUMO-SENP pares foram determinadas por vários métodos, incluindo em gel de poliacrilamida-based western-blot, radIOActive marcado com composto de substrato, fluorescente ou proteína marcada substrato ^8-13. No entanto, as técnicas de gel de poliacrilamida-base, que utilizaram os "nativos" proteínas, mas são trabalhosos e tecnicamente exigente, que não se prestam facilmente à análise quantitativa detalhada. A obtido k _cat / K _M a partir de estudos que utilizam tetrapéptidos ou proteínas com um ACC (ácido 7-amino-4-carbamoylmetylcoumarin) ou AMC (7-amino-4-metilcumarina) fluoróforo ou eram até duas ordens de grandeza mais baixa do que os substratos naturais ou não pode diferenciar claramente as iso-endopeptidase e atividades de SENPs.

Os ensaios de protease recentemente, FRET base foram utilizados para estudar as enzimas deubiquitinating (Dubs) ou SENPs com o par FRET de proteína fluorescente ciano (PCP) e proteína fluorescente amarela (YFP) ^9,10,14,15. A proporção de emissão de aceitador para emissão de dador foi utilizado como parâmetro quantitativo para FRET monitor de sinal para a protease acdade determinação. No entanto, este método ignorado sinal contaminações cruzadas, no comprimento de onda de emissão de aceitador e dador de aceitador e dador de auto-fluorescência e, portanto, não era correcto.

Desenvolveu-se um novo ensaio altamente sensível e quantitativo da protease FRET com base para a determinação dos parâmetros cinéticos de uma pré-maturação por SUMO1 SENP1. Um par de engenharia FRET CyPet e YPet melhorou significativamente a eficiência com FRET e rendimento quântico de fluorescência, foram utilizadas para gerar o CyPet (pré-SUMO1)-substrato YPet ^16. Nós diferenciados e quantificados absolutos sinais de fluorescência contribuídos pelo dador e aceitador FRET e nos comprimentos de onda de emissão e de aceitador, respectivamente. O valor de k _cat / K _M foi obtido como (3,2 ± 0,55) x10 ⁷ M ^-1 s ^-1 de SENP1 para pré-SUMO1, o que está de acordo com os parâmetros cinéticos enzimáticos gerais. Assim, este método é válido e pode ser utilizado umsa geral aproximar para caracterizar outras proteases bem.

Protocolo

1. Construções de plasmídeos

1. Amplificar os quadros de leitura abertos de genes por PCR, e clonar os produtos de PCR em pCRII-TOPO vector.
2. Confirmar os produtos de sequenciação e clonagem do cDNA que codifica CyPet (pré-SUMO1)-YPet, CyPet-SUMO1, YPet e domínios catalíticos de SENP1 para o vector pET28 (b) com um etiqueta de hexa-histidina N-terminal.

2. Protein Expression and Purification

1. Transformar células de Escherichia coli da estirpe BL21 (DE3) com pET28 (b) vectores que codificam CyPet (pré-SUMO1)-YPet, CyPet-SUMO1, YPet e os domínios catalíticos de SENP1.
2. Cultivadas a....

Discussão

FRET tecnologia tem sido utilizada para estudar a maturação de pré-SUMO1 por SENP1 ^9. CFP-YFP foi utilizado como o par de FRET e análise raciométrica, que é a relação entre as emissões de aceitador de doadores, foi utilizada para caracterizar as propriedades cinéticas. No entanto, não há qualquer consideração de dador e aceitador de auto-fluorescência na raciométrica tradicional FRET análise. A relação não é directamente correlacionada com a quantidade de substrato digerido.

Relat.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo
PCR II Kit TOPO	Invitrogen	K466040
2xYT	Pesquisa de Produtos Internationa.l Corp	X15600
Ni-NTA Agrose	Thermo Scientific	88222
Coomassie plus (Bradford) Regent Assay	Thermo Scientific	23238
384-bem placa (fundo de vidro)	Greiner	781892
FlexStation II 384 leitor de placas	Dispositivo Molecular