Quantitativa FRET (Förster Resonance Energy Transfer) Análise para SENP1 Determinação Cinética Protease

Resumo

Um novo método que envolve a análise quantitativa de FRET (Förster Resonance Energy Transfer) sinais é descrito para o estudo de cinética enzimática. K _{M E K Gato Foram obtidos por hidrólise do domínio catalítico de SENP1 (SUMO / Sentrin protease específica 1) para pré-SUMO1 (modificador ubiquitina-like Pequeno). Os princípios gerais deste estudo cinético quantitativo-FRET baseada protease pode ser aplicado a outras proteases.}

Resumo

Reversíveis modificações pós-tradução de proteínas com proteínas ubiquitina ou ubiquitina-like (Ubls) são amplamente usados ​​para regular a actividade da proteína de forma dinâmica e têm diversos papéis em diversos processos biológicos. Por exemplo, SUMO covalentemente modifica um grande número de proteínas ou com papéis importantes em muitos processos celulares, incluindo a regulação do ciclo celular, sobrevivência e morte celular, resposta a danos no ADN, e resposta ao estresse 1-5. SENP, como SUMO-protease específico, funciona como uma endopeptidase na maturação dos precursores SUMO ou como uma isopeptidase para remover SUMO de proteínas-alvo e refrescar o ciclo SUMOilação ^1,3,6,7.

A eficiência catalítica ou especificidade de uma enzima é melhor caracterizada por a razão entre as constantes cinéticas, k _cat / K _M. Em diversos estudos, os parâmetros cinéticos da SUMO-SENP pares foram determinadas por vários métodos, incluindo em gel de poliacrilamida-based western-blot, radIOActive marcado com composto de substrato, fluorescente ou proteína marcada substrato ^8-13. No entanto, as técnicas de gel de poliacrilamida-base, que utilizaram os "nativos" proteínas, mas são trabalhosos e tecnicamente exigente, que não se prestam facilmente à análise quantitativa detalhada. A obtido k _cat / K _M a partir de estudos que utilizam tetrapéptidos ou proteínas com um ACC (ácido 7-amino-4-carbamoylmetylcoumarin) ou AMC (7-amino-4-metilcumarina) fluoróforo ou eram até duas ordens de grandeza mais baixa do que os substratos naturais ou não pode diferenciar claramente as iso-endopeptidase e atividades de SENPs.

Os ensaios de protease recentemente, FRET base foram utilizados para estudar as enzimas deubiquitinating (Dubs) ou SENPs com o par FRET de proteína fluorescente ciano (PCP) e proteína fluorescente amarela (YFP) ^9,10,14,15. A proporção de emissão de aceitador para emissão de dador foi utilizado como parâmetro quantitativo para FRET monitor de sinal para a protease acdade determinação. No entanto, este método ignorado sinal contaminações cruzadas, no comprimento de onda de emissão de aceitador e dador de aceitador e dador de auto-fluorescência e, portanto, não era correcto.

Desenvolveu-se um novo ensaio altamente sensível e quantitativo da protease FRET com base para a determinação dos parâmetros cinéticos de uma pré-maturação por SUMO1 SENP1. Um par de engenharia FRET CyPet e YPet melhorou significativamente a eficiência com FRET e rendimento quântico de fluorescência, foram utilizadas para gerar o CyPet (pré-SUMO1)-substrato YPet ^16. Nós diferenciados e quantificados absolutos sinais de fluorescência contribuídos pelo dador e aceitador FRET e nos comprimentos de onda de emissão e de aceitador, respectivamente. O valor de k _cat / K _M foi obtido como (3,2 ± 0,55) x10 ⁷ M ^-1 s ^-1 de SENP1 para pré-SUMO1, o que está de acordo com os parâmetros cinéticos enzimáticos gerais. Assim, este método é válido e pode ser utilizado umsa geral aproximar para caracterizar outras proteases bem.

Protocolo

1. Construções de plasmídeos

1. Amplificar os quadros de leitura abertos de genes por PCR, e clonar os produtos de PCR em pCRII-TOPO vector.
2. Confirmar os produtos de sequenciação e clonagem do cDNA que codifica CyPet (pré-SUMO1)-YPet, CyPet-SUMO1, YPet e domínios catalíticos de SENP1 para o vector pET28 (b) com um etiqueta de hexa-histidina N-terminal.

2. Protein Expression and Purification

1. Transformar células de Escherichia coli da estirpe BL21 (DE3) com pET28 (b) vectores que codificam CyPet (pré-SUMO1)-YPet, CyPet-SUMO1, YPet e os domínios catalíticos de SENP1.
2. Cultivadas as bactérias transformadas em meio 2xYT durante 3 horas a 37 ° C (com agitação a 250 rpm) para atingir uma densidade óptica de 0,5 a 600 nm.
3. Adicione 100 ^ M isopropil-β-D-tiogalactósido (IPTG) (concentração final) para induzir a expressão da proteína e agitar durante 16 horas a 25 ° C a 200 rpm.
4. Colheita das bactérias por centrifugção a 10.000 rpm a 4 ° C durante 5 min e ressuspender os em um tampão de 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), NaCl 50 mM e 5 mM de imidazole.
5. Sonicar as células durante 10 minutos em intervalos de 5 s com um ajuste de potência de 25 W, utilizando MiSonics sonicador 4000 e recolhê-las por meio de centrifugação a 35.000 xg, a 4 ° C durante 30 min.
6. Defina-se a coluna com 500 ml de pérolas de Ni-NTA de uma cultura de L e transferir o sobrenadante para a coluna.
7. Lava-se a resina com tampão de 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), NaCl 500 mM, imidazol 10 mM e duas vezes.
8. Proteína elui-se com tampão de 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), NaCl 500 mM, e 500 mM de imidazole e diálise num tampão de 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), NaCl 50 mM e 1 mM de ditiotreitol (DTT) a 4 ° C durante a noite.
9. Determinar as concentrações das proteínas purificadas pelo ensaio de Bradford. Método alternativo para a medição da concentração de proteína será SDS-PAGE electroforese em gel e, em seguida, coradas com azul de Coomassie seguido de imagiologiaquantitativo.

3. Quantitativa FRET Análise de Espectro

1. A estratégia geral para o ensaio foi baseado em FRET de sinalização (Figura 1). O par FRET, CyPet e YPet, foi etiquetada com o N-e C-terminais, respectivamente, da pré-SUMO1. SENP1 cliva a proteína de fusão CyPet (pré-SUMO1) YPet-no local Gly-Gly, em SUMO1 do C-terminal e, deste modo, liberta a cauda SUMO com YPet. O sinal FRET é interrompido, resultando num aumento da emissão de CyPet e uma diminuição dramática das emissões de YPet no comprimento de onda de excitação CyPet.
2. Quando excitado por luz de comprimento de onda de 414 nm, a emissão total de fluorescência de CyPet-(pré-SUMO1)-YPet a 530 nm pode ser obtido a partir de três fontes: emissões absoluto FRET induzida YPet, a CyPet directo emissão e YPet directa de emissão (figura 2).

onde FL _{530/414 <}/ Sub> é o total de emissões de fluorescência a 530 nm quando excitado a 414 nm, FL _FRET é o absoluto FRET sinal, FL _{CyPet (cont)} é a emissão direta CyPet quando excitado a 414 nm, e FL _{YPet (cont)} é o YPet dirigir emissão quando excitado a 414 nm. O índice de (cont) representa contribuição.

3. A emissão directa de CyPet a 530 nm foi proporcional à sua emissão a 475 nm quando excitado a 414 nm, com uma proporção constante de α. CyPet-SUMO1 foi preparada em concentrações de 50, 100, 200, 500, e 750 nM e 1 mM , e as emissões de 475 e 530 nm foi medida após a excitação a 414 nm para determinar α (Figura 3-1).
4. A emissão directa de YPet a 530 nm sob excitação em 414 nm foi proporcional à sua emissão a 530 nm quando excitado a 475 nm, com uma proporção constante de β. YPet foi preparada em concentrações de 50, 100, 200, 500, 750 And 1000 nM, e a emissão a 530 nm foi medida em que as amostras foram excitados por comprimentos de onda de 414 e 475 nm para determinar β (Figura 3-2).
5. Quando CyPet (pré-SUMO1)-YPet foi digerido por SENP1, a clivagem libertado CyPet-SUMO1 ea cauda SUMO1 com YPet. Quando o composto foi excitada a 414 nm, a emissão de fluorescência a 530 nm (FL _'530/414) foi reduzida, mas ainda podem ser divididas em três partes como:

onde FL _'530/414 é a emissão total de fluorescência a 530 nm após a digestão, quando excitado a 414 nm, FL' _FRET é o restante sinal FRET absoluto, _CyPet FL _'(475/414) é a emissão a 475 nm CyPet após a digestão quando excitada a 414 nm (a emissão CyPet aqui é a partir de duas partes: CyPet não digerido (pré-SUMO1)-YPet e digerido CyPet-SUMO1) e FL _YPet(530/475) é a emissão YPet quando excitado a 475 nm, que é constante se CyPet (pré-SUMO1)-YPet é digerido ou não.

6. Após a digestão por SENP1, o restante FRET emissão (FL _'FRET) é a seguinte:

em que C é a concentração total de CyPet (pré-SUMO1)-YPet e x é a concentração de digerido CyPet (pré-SUMO1)-YPet.

7. Através da combinação de todos os elementos, a emissão de fluorescência detectada a 530 nm sob excitação de 414 nm ₍₅₃₀ FL _{'/ 414)} é o seguinte:

4. FRET baseada Protease Assay para Estudo Cinético Enzyme

1. CyPet (pré-SUMO1)-YPet foi incubada com o domínio catalítico de SENP1 a 37 ° C num tampão de 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), NaCl 50 mM, 0,1% (v /v) de Tween-20 e 1 mM de DTT a um volume total de 80 ml e transferidas para placas de 384 poços.
2. Ensaios foram realizados através da medição da emissão de fluorescência a 475 e 530 nm, após uma excitação a 414 nm num leitor de fluorescência de placas com múltiplas cavidades, durante 5 min com intervalos de 15 seg.
3. A velocidade da reacção (v) foi correlacionado com a alteração da quantidade de substrato (S), como:

4. A concentração do produto aumentou exponencialmente a partir de 0, tal como [S] ₀ (concentração de substrato original) quando t = 0:

5. Quando t = 0, a velocidade inicial (V ₀₎ é a seguinte:

6. O concentration de SENP1 foi fixado, e a concentração de CyPet (pré-SUMO1)-YPet foi aumentada de 100 vezes mais do que a concentração de enzima, o que é exigido por equação de Michaelis-Menten.
7. Todas as leituras de fluorescência foram analisados ​​pelo método de análise quantitativa FRET e representado no GraphPad Software Prism V para ajustar a equação de Michaelis Menten. A análise de regressão não-linear também pode ser realizada com o auxílio de pacotes de software mais comuns, tais como programas de folha de cálculo (tais como o Microsoft Excel).

5. Resultados representativos

Maturação de pré-SUMO1 por SENP1 pode ser determinada por monitorização das alterações do sinal de fluorescência a 475 e 530 nm durante o processo. O resultado mostrou que a velocidade de pré-SUMO1 digestão por SENP1 de um modo de substrato dependente da dose (Figura 4). Isto sugere que o domínio catalítico de SENP1 exibe uma actividade excelente para a maturação de pré-SUMO1. A reação inicialção velocidades foram calculadas através da análise acima, com diferentes concentrações de substrato (Tabela 1).

O k _cat / K _M é geralmente usado para comparar a eficiência de enzimas diferentes com um substrato de uma enzima específica ou com diferentes substratos. K _M e V _max pode ser obtido a partir da equação de Michaelis-Menten, traçando as velocidades iniciais diferentes, correspondentes para as diferentes concentrações de CyPet (pré-SUMO1)-YPet (Figura 5) k _cat foi obtido como.:

De acordo com a análise acima, o K calculado _M foi de 0,21 ± 0,04 mM, o _gato k foi 6,90 ± 0,28 s ^-1, e razão k _cat / K _M foi de (3,2 ± 0,55) x10 ⁷ M ^-1 > S ^-1.

Figura 1. Gráfico de FRET ensaio baseado em protease para a maturação de pré-SENP sumos.

Figura 2. Análise quantitativa de sinal fluorescente como contribuições pelo dador-aceitador e FRET. Dissecação de espectros de emissão a partir de CyPet (pré-SUMO1) YPet sob excitação a 414 nm. _CyPet FL _(530/414) é emissão CyPet de a 530 nm, com excitação de 414 nm, FL _FRET é a FRET induzida emissão YPet a 530 nm sob excitação de 414 nm, e FL _{YPet (530/414)} é a emissão YPet de a 530 nm, com excitação de 414 nm.

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Figura 3. Cálculo de direção α fator de emissão e β.

Figura 4. Análise quantitativa de CyPet (pré-SUMO1) YPet digerido por razões diferentes do domínio catalítico de SENP1. As reações foram monitoradas dentro primeiros 5 min.

Figura 5. Michaelis-Menten análise gráfica de digestão CyPet (pré-SUMO1)-YPet do por SENP1. Os dados foram traçados e analisados ​​por GraphPad Prism V e de regressão não-linear.

[S] (uM)	V 0 (^ M / s)
0,115	0,0023 ± 0,00005
0,214	0,0028 ± 0,00004
0,407	0,0033 ± 0,00007
0,594	0,0037 ± 0,00013
0,725	0,0043 ± 0,00012
1,471	0,0051 ± 0,00036
1,899	0,0050 ± 0,00031
2,300	0,0050 ± 0,00062

Tabela 1. Determinação velocidades iniciais de maturação de pré-SUMO1 por SENP1. Em cada concentração de substrato, quatro amostras foram utilizadas para medir a digestão. O desvio padrão foi de variações destas quatro amostras.

K M (| iM)	k cat (s-1)	k cat / K m (M -1 • s-1)
0,21 ± 0,04	6,90 ± 0,28	3,2 ± 0,55 x 10 7

Tabela 2. Parâmetros cinéticos de maturação de pré-SUMO1 por SENP1 por análise quantitativa FRET. O desvio padrão foi de quatro amostras de cada concentração de substrato.

Discussão

FRET tecnologia tem sido utilizada para estudar a maturação de pré-SUMO1 por SENP1 ^9. CFP-YFP foi utilizado como o par de FRET e análise raciométrica, que é a relação entre as emissões de aceitador de doadores, foi utilizada para caracterizar as propriedades cinéticas. No entanto, não há qualquer consideração de dador e aceitador de auto-fluorescência na raciométrica tradicional FRET análise. A relação não é directamente correlacionada com a quantidade de substrato digerido.

Relat...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo
PCR II Kit TOPO	Invitrogen	K466040
2xYT	Pesquisa de Produtos Internationa.l Corp	X15600
Ni-NTA Agrose	Thermo Scientific	88222
Coomassie plus (Bradford) Regent Assay	Thermo Scientific	23238
384-bem placa (fundo de vidro)	Greiner	781892
FlexStation II 384 leitor de placas	Dispositivo Molecular