Apresentamos um novo método de microgavagem de larvas de peixe-zebra utilizando equipamentos padrão de microinjeção de embriões e estereomicroscopia. Demonstramos que a microgavagem é uma técnica segura e eficiente, útil para administrar quantidades controladas de diversos materiais diretamente na luz intestinal de larvas de peixe-zebra.
O peixe-zebra emergiu como um organismo modelo poderoso para o estudo do desenvolvimento intestinal1-5, da fisiologia6-11, de doenças12-16 e das interações entre hospedeiro e microrganismos17-25. Abordagens experimentais para o estudo da biologia intestinal frequentemente requerem a introdução in vivo de materiais selecionados na luz do intestino. No modelo de peixe-zebra larval, isso é tipicamente realizado imergindo os peixes em uma solução do material escolhido ou por injeção através da parede abdominal. Utilizando o método de imersão, é difícil monitorar ou controlar com precisão a rota ou o momento da entrega do material ao intestino. Por esse motivo, a exposição por imersão pode causar toxicidade indesejada e outros efeitos em tecidos extraintestinais, limitando a faixa potencial de quantidades de material que podem ser entregues ao intestino. Além disso, a quantidade de material ingerido durante a exposição por imersão pode variar significativamente entre larvas individuais26. Embora esses problemas não ocorram durante a injeção direta através da parede abdominal, a injeção adequada é difícil e causa danos teciduais que poderiam influenciar os resultados experimentais. Apresentamos um método de microsondagem em larvas de peixe-zebra. O objetivo deste método é fornecer uma maneira segura, eficaz e consistente de entregar material diretamente para a luz do intestino anterior em larvas de peixe-zebra com tempo controlado. A microsondagem utiliza equipamentos padrão de microinjeção de embriões e estereomicroscopia comuns na maioria dos laboratórios que realizam pesquisas com peixe-zebra. Uma vez que os peixes são adequadamente posicionados em metilcelulose, a sondagem pode ser realizada rapidamente a uma taxa de aproximadamente 7-10 peixes/min, e a sobrevivência pós-sondagem aproxima-se de 100%, dependendo do material administrado. Também demonstramos que a microsondagem pode permitir o carregamento da luz intestinal com altas concentrações de materiais que são letais para os peixes quando expostos por imersão. Para demonstrar a utilidade deste método, apresentamos um ensaio de microsondagem com dextrano fluorescente que pode ser usado para quantificar o trânsito da luz intestinal para espaços extraintestinais. Esse teste pode ser usado para verificar a execução correta do procedimento de microsondagem e também fornece um ensaio inovador em peixe-zebra para examinar a integridade da barreira epitelial intestinal sob diferentes condições experimentais (por exemplo, manipulação genética, tratamento com fármacos ou exposição a fatores ambientais). Além disso, mostramos como a sondagem pode ser usada para avaliar a motilidade intestinal mediante a administração de microesferas fluorescentes e o monitoramento subsequente de seu trânsito. A microsondagem pode ser aplicada para entregar diversos materiais, tais como microrganismos vivos, fatores microbianos secretados/toxinas, agentes farmacológicos e sondas fisiológicas. Com essas capacidades, o método de microsondagem em larvas de peixe-zebra tem o potencial de aprimorar uma ampla gama de áreas de pesquisa que utilizam o sistema modelo de peixe-zebra.
Utilizamos protocolos publicados de manejo e manutenção padrão de peixe-zebra para obter larvas para microgavagem27. Utilizamos principalmente reprodução natural para propagar os peixes, que são mantidos em um ciclo de 14 horas de luz e 10 horas de escuro. Este protocolo foi otimizado para microgavagem de larvas de peixe-zebra com 6 a 7 dias pós-fertilização (dpf). Prevemos que estes métodos sejam geralmente aplicáveis a estágios de desenvolvimento mais jovens e mais velhos com modificações mínimas. Salvo indicação em contrário, utilizamos a linhagem selvagem TL de peixe-zebra com 6 dpf, e os peixes não foram alimentados. Todos os experimentos foram realiza....
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Quando a gavagem é realizada corretamente, o material administrado deve estar inteiramente contido no intestino anterior, com pouco ou nenhum resíduo no esôfago (Figura 3). Deve-se escolher um volume de administração que possa ser acomodado dentro do bulbo anterior e que não vaze pela cloaca ou pelo esôfago. Se o volume do material ou a pressão de administração forem excessivos, a força física da gavagem poderá causar danos ou vazamento através do epitélio. Também poderá expelir ou alterar outros compone.......
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Neste trabalho, descrevemos um novo protocolo para a entrega direta de materiais ao intestino de larvas de peixe-zebra por meio de microsondagem. Existem várias etapas críticas ao longo do procedimento que devem ser levadas em consideração. Primeiramente, as larvas de peixe-zebra devem estar em boas condições de saúde antes do experimento de sondagem, a fim de prevenir mortes não relacionadas ao tratamento. Outro fator importante é a qualidade da agulha de sondagem. Uma das partes mais difíceis do protocolo é cortar a ag.......
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Nenhum conflito de interesses declarado.
Agradecemos aos membros do laboratório de Rawls pelas sugestões úteis sobre o conteúdo e ao Dr. Alan Fanning pelas valiosas discussões sobre permeabilidade de tamanho e métodos de disruptura das junções íntimas. Agradecemos também ao Dr. Michael Chua e ao Dr. Neal Kramarcy da Michael Hooker Microscopy Facility pelo apoio com o microscópio confocal. Este trabalho foi apoiado por subsídios dos National Institutes of Health T32 DK007737-15 (bolsista J.L.C.), F32 DK094592 (para J.L.C.) e R01 DK081426 (para J.F.R.).
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Finquel (metanosulfonato de tricaina) | Argent Chemical Laboratories | MS-222 | Anestesia de larvas |
| Solução de vermelho de fenol | Sigma-Aldrich | P0290-100 ml | 0,5% em DPBS, testado para cultura celular |
| Óleo mineral, leve, branco (alta pureza) | Amresco | J217-500 ml | Para reenchimento da agulha e teste de volume |
| Dextrano TxRed, peso molecular 10.000, fixável por lisina | Invitrogen/ Molecular Probes | D-1863 | Suspensão a 1% em PBS 1x/vermelho de fenol |
| FM4-64FX | Invitrogen/ Molecular Probes | F34653 | Estoque a 5 mM em água |
| Metilcelulose | MP Biochemicals | 0215549590 | |
| Capilares de vidro borossilicato | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | Diâmetro externo 1,14 mm, diâmetro interno 0,53 mm, comprimento 3,5 polegadas |
| Forma plástica para fabricação de moldes | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
| Unidade de microinjeção Nanoject II | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| Puxador de micropipetas Flaming Brown, filamento largo de 3,0 mm | Sutter Instrument Co. | P-97, FT330B | Fabricação de agulhas |
| Pinça Dumont #5 para estudantes | Fine Science Tools | 91150-20 | 0,1 x 0,06 mm, corte de agulhas |
| Retículo ocular, 5 mm - 100 divisões | Leica | 10394771 | Corte de agulhas |
| Microforja | Narishige | MF-900 | Corte de agulhas e polimento a fogo |
| Agulha para seringa Tuberculin SlipTip | Becton Dickinson | 309626 | 1 ml, agulha 25G 5/8 |
| Microesferas Fluoresbrite YG (2,0 μm) | Polysciences, Inc. | 18338 | Análise da motilidade intestinal |
| Microsscópio estereoscópico | Leica | S6E | Procedimento de gavagem |
| Microsscópio estereoscópico de fluorescência | Leica | M205C | Ensaio de barreira com dextrano |
| Microscópio confocal | Zeiss | LSM510 | Imagem do dextrano na circulação |
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