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Artigo de método

Microgavage de larvas do peixe

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⸱

DOI:

10.3791/4434

⸱

20 de fevereiro de 2013

 , 
1Department of Cell and Molecular Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill

Neste artigo

Resumo

Apresentamos um novo método de microgavagem de larvas de peixe-zebra utilizando equipamentos padrão de microinjeção de embriões e estereomicroscopia. Demonstramos que a microgavagem é uma técnica segura e eficiente, útil para administrar quantidades controladas de diversos materiais diretamente na luz intestinal de larvas de peixe-zebra.

Resumo

O peixe-zebra emergiu como um organismo modelo poderoso para o estudo do desenvolvimento intestinal1-5, da fisiologia6-11, de doenças12-16 e das interações entre hospedeiro e microrganismos17-25. Abordagens experimentais para o estudo da biologia intestinal frequentemente requerem a introdução in vivo de materiais selecionados na luz do intestino. No modelo de peixe-zebra larval, isso é tipicamente realizado imergindo os peixes em uma solução do material escolhido ou por injeção através da parede abdominal. Utilizando o método de imersão, é difícil monitorar ou controlar com precisão a rota ou o momento da entrega do material ao intestino. Por esse motivo, a exposição por imersão pode causar toxicidade indesejada e outros efeitos em tecidos extraintestinais, limitando a faixa potencial de quantidades de material que podem ser entregues ao intestino. Além disso, a quantidade de material ingerido durante a exposição por imersão pode variar significativamente entre larvas individuais26. Embora esses problemas não ocorram durante a injeção direta através da parede abdominal, a injeção adequada é difícil e causa danos teciduais que poderiam influenciar os resultados experimentais. Apresentamos um método de microsondagem em larvas de peixe-zebra. O objetivo deste método é fornecer uma maneira segura, eficaz e consistente de entregar material diretamente para a luz do intestino anterior em larvas de peixe-zebra com tempo controlado. A microsondagem utiliza equipamentos padrão de microinjeção de embriões e estereomicroscopia comuns na maioria dos laboratórios que realizam pesquisas com peixe-zebra. Uma vez que os peixes são adequadamente posicionados em metilcelulose, a sondagem pode ser realizada rapidamente a uma taxa de aproximadamente 7-10 peixes/min, e a sobrevivência pós-sondagem aproxima-se de 100%, dependendo do material administrado. Também demonstramos que a microsondagem pode permitir o carregamento da luz intestinal com altas concentrações de materiais que são letais para os peixes quando expostos por imersão. Para demonstrar a utilidade deste método, apresentamos um ensaio de microsondagem com dextrano fluorescente que pode ser usado para quantificar o trânsito da luz intestinal para espaços extraintestinais. Esse teste pode ser usado para verificar a execução correta do procedimento de microsondagem e também fornece um ensaio inovador em peixe-zebra para examinar a integridade da barreira epitelial intestinal sob diferentes condições experimentais (por exemplo, manipulação genética, tratamento com fármacos ou exposição a fatores ambientais). Além disso, mostramos como a sondagem pode ser usada para avaliar a motilidade intestinal mediante a administração de microesferas fluorescentes e o monitoramento subsequente de seu trânsito. A microsondagem pode ser aplicada para entregar diversos materiais, tais como microrganismos vivos, fatores microbianos secretados/toxinas, agentes farmacológicos e sondas fisiológicas. Com essas capacidades, o método de microsondagem em larvas de peixe-zebra tem o potencial de aprimorar uma ampla gama de áreas de pesquisa que utilizam o sistema modelo de peixe-zebra.

Protocolo

Utilizamos protocolos publicados de manejo e manutenção padrão de peixe-zebra para obter larvas para microgavagem27. Utilizamos principalmente reprodução natural para propagar os peixes, que são mantidos em um ciclo de 14 horas de luz e 10 horas de escuro. Este protocolo foi otimizado para microgavagem de larvas de peixe-zebra com 6 a 7 dias pós-fertilização (dpf). Prevemos que estes métodos sejam geralmente aplicáveis a estágios de desenvolvimento mais jovens e mais velhos com modificações mínimas. Salvo indicação em contrário, utilizamos a linhagem selvagem TL de peixe-zebra com 6 dpf, e os peixes não foram alimentados. Todos os experimentos foram realizados em água do sistema obtida a partir da nossa instalação convencional de aquicultura de peixe-zebra; no entanto, qualquer meio apropriado para peixe-zebra (por exemplo, meio de embrião ou meio gnotobiótico para peixe-zebra (GZM)28) pode ser utilizado. Neste protocolo, referimo-nos a "meio para peixe-zebra" para representar o meio de escolha do usuário.

1. Preparação de Metilcelulose, Molde para Gavagem e Fabricação da Agulha de Microgavagem

No dia anterior ou no início do dia do experimento, prepare a metilcelulose, a forma de agarose para estabilização das larvas e as agulhas para microadministração gástrica.

  1. Dissolva 3 g de metilcelulose em 100 ml de água estéril, desionizada ou meio para peixe-zebra (dependendo da sua aplicação) para obter uma solução a 3%. Adicione uma barra de agitação magnética ao frasco, aqueça a água até próximo da fervura e coloque-o em uma placa de agitação em alta temperatura. Durante a agitação, polvilhe lentamente a metilcelulose para garantir que não forme grumos. Reduza lentamente a velocidade da agitação e a temperatura da placa de agitação ao longo do dia até atingir a temperatura ambiente.
  2. Continue agitando lentamente durante a noite até que a metilcelulose esteja completamente dissolvida. A solução pode ser armazenada à temperatura ambiente por vários meses em um recipiente fechado.
  3. Prepare um molde de gel de agarose a 3% em uma placa de Petri de 10 cm utilizando um molde plástico (Adaptive Science Tools, TU-1) de acordo com as instruções do fabricante. Sobreponha com parafilm e armazene a 4 °C até o uso, para evitar dessecação. Aqueça até a temperatura ambiente ou 28 °C antes do experimento. Moldes de agarose geralmente podem ser reutilizados várias vezes.
  4. Puxe várias agulhas de gavagem utilizando capilares de vidro borossilicato e um puxador de micropipetas Flaming Brown equipado com um filamento de aquecimento de ranhura larga (FT330B). Os programas que utilizamos para a fabricação das agulhas são os seguintes:
Tipo de agulhaPressãoCalorTraçãoVelocidadeTempo
embrião50031510050200
gavagem50031512575200

Como os filamentos podem variar entre os instrumentos, registre o tempo de rampa (tempo de aquecimento ativo). Nosso tempo de rampa varia entre 8,57 e 8,79 ms para este programa. Este programa produz agulhas mais curtas e mais robustas do que as agulhas tradicionais para microinjeção (Figura 1). Essas configurações podem precisar ser otimizadas para uso em diferentes puxadores de micropipetas.

2. Corte, Carregamento e Calibração das Agulhas de Microgavagem

Observação*: O corte da ponta da agulha é uma etapa crítica neste protocolo. Além disso, os métodos de carregamento e calibração da agulha variarão conforme o tipo de unidade de microinjeção utilizada. Nós otimizamos este protocolo utilizando microinjetores Drummond II, mas esperamos que ele também seja aplicável a outros instrumentos de microinjeção com pequenas modificações. Como os equipamentos de injeção e os puxadores de agulhas podem variar entre laboratórios, será importante medir/calibrar os volumes de injeção (ver seção 2.8).

  1. As agulhas são cortadas sob um estereomicroscópio. Utilizamos um estereomicroscópio Leica S6E ajustado à ampliação de 2,5x. Nessa configuração, nossa ocular com retículo de 100 divisões possui 2 mm de comprimento.
  2. Alinhe a ponta da agulha com o final da escala do retículo (marca de divisão 100) e corte a agulha usando pinças finas de relojoeiro a aproximadamente 1 mm da ponta (marca de divisão 48-50) (Figura 1A).
  3. A agulha deve ter diâmetro de aproximadamente 27-30 μm e ser romba. Examine as pontas das agulhas com ampliação de 100x. Agulhas afiadas ou irregulares aumentam a probabilidade de danos durante a gavagem e devem ser evitadas, se possível.
  4. Alternativamente, quando disponível, pode-se utilizar um microforno para melhor controle do ponto de corte da agulha e para polir suas pontas com chama, removendo bordas afiadas (Figura 1B).
  5. Prepare a solução de gavagem. Na maioria das aplicações, preparamos a solução com a adição de uma diluição 1:10 de uma solução a 0,5% de vermelho de fenol em solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) (Sigma-Aldrich), para garantir que a solução seja visível sob o estereomicroscópio, permitindo monitorar o funcionamento adequado do microinjetor e a colocação da solução de gavagem no bulbo anterior. Corantes de carga diferentes do vermelho de fenol não foram avaliados, mas poderiam ser utilizados.
  6. Prepare a agulha de gavagem enchendo-a com óleo mineral usando uma seringa de 1 ml com agulha 25G 5/8. Em seguida, monte-a na unidade de microinjeção Nanoject II.
  7. Envolva um prato de Petri plástico de 10 cm com parafilm para fornecer uma superfície plana e impermeável e alíquota cerca de 2 μl da solução de gavagem sobre o parafilm. Encha manualmente a agulha de gavagem, tomando cuidado para evitar a formação de bolhas de ar no óleo mineral.
  8. Para testar o funcionamento do microinjetor e calibrar o volume de ejeção, encha um prato de Petri de 3 cm com óleo mineral e injete no óleo até que as gotículas apresentem tamanho consistente. Meça o diâmetro das gotículas usando o retículo ou uma função de medição do estereomicroscópio, se disponível. Calcule o volume das gotículas (Equação: V=4/3πr3). A consistência do volume entre agulhas é representada graficamente (Figura 1C).
  9. Enxágue a ponta da agulha com submersões repetidas em meio limpo para peixes-zebra para remover o óleo mineral residual antes de iniciar a gavagem. O óleo mineral é muito denso e pode causar danos aos tecidos epiteliais se não for removido da ponta da agulha.

3. Anestesia, Montagem e Gavagem de Larvas de Peixe-zebra

  1. Aqueça o molde de agarose à temperatura ambiente ou a 28 °C antes do experimento.
  2. Prepare o molde de agarose para a gavagem cobrindo 3 ranhuras com metilcelulose a 3%. Use uma quantidade de metilcelulose suficiente para cobrir as ranhuras e segurar os peixes, mas não tão escassa que seque rapidamente.
  3. Em uma placa de 6 poços limpa, distribua larvas de peixe-zebra para cada grupo experimental em poços separados, cada um contendo 3,5-4,0 ml de meio para peixe-zebra.
  4. Prepare uma solução de tricaina 3x (0,05% p/v) no meio apropriado para peixe-zebra. Anestesie os peixes um poço por vez, misturando um volume igual de tricaina 3x ao poço contendo as larvas, obtendo uma concentração final de 1,5x (0,025%), e agite suavemente.
  5. Assim que os peixes-zebra pararem de se mover, remova-os do poço usando uma pipeta de Pasteur de vidro com orifício largo e uma bomba de pipetagem, e coloque-os um a um sobre a metilcelulose com as cabeças no ângulo de 45° da ranhura e as caudas voltadas para o ângulo de 90° da ranhura. Pressione-os suavemente na metilcelulose com uma sonda de dissecação romba para estabilizar sua posição.
  6. Ajuste o equipamento de microinjeção Nanoject II de modo que a agulha esteja inclinada em um ângulo raso, aproximadamente paralelo ao ângulo de 45° do molde de agarose. Certifique-se de que o alcance de extensão da agulha seja suficiente para ultrapassar o fundo do poço do molde, de modo que menos ajustes sejam necessários após os peixes serem posicionados.
  7. Configure a unidade de microinjeção para liberar 4,6 nl (máximo) na configuração de injeção lenta (23 nl/seg). Nessas condições, o volume administrado deve preencher apenas a bolsa intestinal anterior, sem vazar pelo esôfago ou cloaca. Volumes menores podem ser utilizados dependendo do objetivo do experimento.
  8. Use uma das mãos para fazer pequenos ajustes na placa contendo as larvas imobilizadas, enquanto simultaneamente usa a outra mão para controlar o manipulador da unidade de microinjeção.
  9. Manobre suavemente a agulha de gavagem até a boca do peixe anestesiado, através do esôfago, e deprime levemente o esfíncter esofágico para introduzir a ponta da agulha de gavagem logo dentro da bolsa intestinal anterior (Figura 2, etapas 1-2, a&b).
  10. Uma vez dentro da bolsa anterior, pressione suavemente o pedal do pé ou o botão de injeção para administrar o material. Retire a agulha rapidamente e com suavidade, tentando não liberar quantidades significativas de material no esôfago (Figura 2, etapas 3-4).
  11. Após a gavagem, use uma pipeta de Pasteur de vidro com orifício largo e uma bomba de pipetagem para mover suavemente as larvas de peixe-zebra para meio fresco. Encha a pipeta com água até cerca de 2,5 cm acima da curvatura do pescoço, crie um pequeno bolsão de água na metilcelulose junto à cabeça da larva para soltá-la, levante suavemente a cabeça até a boca da pipeta, e aspire a larva para fora da metilcelulose. Expulse suavemente o peixe e toda a água da pipeta para um recipiente contendo meio fresco.
  12. Lave as larvas em meio fresco pipetando suavemente para cima e para baixo ou salpicando com meio várias vezes para remover a metilcelulose e reanimar as larvas da anestesia. Transfira as larvas para uma placa de Petri ou placa de 6 poços até que sejam necessárias para análises e imagens subsequentes.

4. Ensaio com Dextrana para Testar a Segurança da Gavagem e a Integridade da Barreira Intestinal

A microgavagem pode ser utilizada para administrar diversos materiais no intestino. Como exemplo, fornecemos abaixo um protocolo para a gavagem de um dextrano de 10 kD conjugado com Texas Red, a fim de analisar a integridade da barreira do epitélio intestinal. Existem pelo menos duas rotas potenciais de permeabilidade paracelular, com diferenças na seletividade com base na carga e no tamanho dos solutos, denominadas vias do "poro" ou do "vazamento"29. Como este dextrano é grande demais para ser absorvido através do epitélio intestinal pela via paracelular do poro (limite de tamanho ~4Å, dextrano de 10kD = ~23Å)9,30-32, ele deve permanecer no lúmen caso a integridade da barreira intestinal não esteja comprometida. Embora o dextrano de 10 kD possa ser transportado pela via paracelular de vazamento, esta via possui menor capacidade e cinética mais lenta29,33 e, portanto, é improvável que ocorra dentro do período de tempo deste ensaio. Um tratamento de "controle positivo" para romper a integridade da barreira é a inclusão de EDTA, que rompe as junções apertadas do epitélio34,35. Este ensaio de gavagem com dextrano pode ser usado como um teste de controle de qualidade para demonstrar que o procedimento de gavagem está sendo realizado com segurança, sem danos teciduais não intencionais. Além disso, este ensaio pode ser utilizado para testar a integridade da barreira intestinal em função do genótipo ou do tratamento.

  1. Prepare as seguintes soluções para gavagem: dextrana 1%/PBS 1x/vermelho de fenol 0,05% e dextrana 1%/EDTA 20 mM/PBS 1x/vermelho de fenol 0,05% (controle positivo). O estoque de dextrana 5% em ddH2O é armazenado em alíquotas de 50 μl a -20 °C para reduzir o número de ciclos de congelamento-descongelamento. Além disso, prepare uma solução controle de gavagem contendo PBS 1x/vermelho de fenol 0,05%.
    controle + (EDTA)sem EDTA
 estoquefinalfator de diluição10 μl10 μl
EDTA, pH 8200 mM20 mM1010
Dextrana5%1%522
PBS10x1x1011
Fenol Vermelho0,50%0,05%1011
   subtotal:54
   ddH2O:56
   Total:1010
  1. Utilize o protocolo da seção 3 para administrar por gavagem grupos de 10 a 20 larvas de peixe-zebra para cada condição experimental. Repita isso em grupos duplicados ou triplicados, se possível.
  2. Após a gavagem, recupere as larvas da anestesia e permita que nadem livremente em meio fresco.
  3. Dezesseis a vinte minutos após a gavagem, reanestesie as larvas conforme o passo 3.3. Posicione as larvas em metilcelulose a 3% sobre um bloco de agarose a 3% (isso reduz o brilho de fundo durante a aquisição de imagens).
  4. Adquira imagens das larvas com um estereomicroscópio de fluorescência (por exemplo, Leica M205C) e um conjunto de filtros Texas Red, em uma ampliação que mostre as larvas desde o focinho até imediatamente posterior ao fim da cloaca.
  5. Adquira todas as imagens com as mesmas configurações de exposição para que possam ser quantificadas e comparadas posteriormente. A fluorescência será intensa na luz intestinal de todas as larvas injetadas com dextrano, mas a função de barreira é avaliada pelo nível de dextrano que aparece em tecidos extra-intestinais (ou seja, no tronco e nos vasos sanguíneos) (Figura 5). Ajuste a exposição para configurações que permitam a visualização da fluorescência no tronco, mesmo que isso superexponha a fluorescência da luz.
  6. Organize os horários de gavagem de forma que cada grupo passe aproximadamente o mesmo tempo em recuperação após a gavagem e seja analisado aproximadamente no mesmo momento pós-gavagem. Para este experimento, cada grupo leva cerca de 1 hora para ser processado por uma pessoa. Os peixes são anestesiados 18-20 minutos após a gavagem, e a aquisição de imagens leva cerca de 1-2 minutos por peixe.
  7. Utilize um programa de análise de imagens, como o ImageJ, para quantificar a intensidade média relativa de fluorescência em uma região do tronco logo acima do intestino. Normalize esses valores subtraindo uma medida de fundo obtida em uma região da imagem fora do peixe.
  8. Represente graficamente e analise os dados da análise de imagens utilizando o GraphPad Prism ou outro software estatístico semelhante.

5. Ensaio com microesferas fluorescentes para testar a motilidade intestinal

A gavagem proporciona maior controle sobre o momento e a quantidade de material administrado ao intestino, tornando-a um método alternativo ideal para estudos de motilidade intestinal. Técnicas previamente publicadas para medir a motilidade intestinal em larvas de peixe-zebra incluem a observação direta de contrações e ondas intestinais por microscopia1,21,36 ou a alimentação de larvas com ração misturada a microesferas de policloreto de vinila fluorescentes verde-amareladas26. Em alguns estudos, a quantificação dos padrões de motilidade intestinal foi aprimorada pela imersão das larvas em meio contendo corante alimentar37 ou por uma técnica especializada de análise de vídeo denominada mapeamento espaço-temporal38,39. Aqui apresentamos um estudo de prova de conceito para demonstrar que é possível realizar a gavagem de microesferas fluorescentes na bolsa anterior do intestino, e que o rastreamento do movimento das microesferas pode ser utilizado para avaliar a motilidade intestinal (Figura 6). A principal diferença entre este método e a abordagem de Field e colegas26 é que as microesferas são introduzidas isoladamente e não podem ser incorporadas à ração devido aos limites do diâmetro da agulha de gavagem.

  1. Mantenha larvas de peixe-zebra em placas de 10 cm com 35 ml de meio até que o experimento seja realizado aos 7 dpf. Inicie a alimentação das larvas uma vez ao dia pela manhã a partir dos 5 dpf com cerca de 0,6 mg de alimento em pó (dieta para larvas, conforme descrito anteriormente40; administrado usando uma alça de inoculação estéril de 1 mm).
  2. Agite suavemente o frasco de microesferas de poliestireno Fluoresbrite YG de 2,0 μm (~2,5% de suspensão aquosa) para homogeneizar a suspensão. Aliquote uma gota do frasco sobre parafina para que um volume específico possa ser medido por pipetagem.
  3. Em um tubo eppendorf, centrifugue as microesferas em baixa velocidade em uma microcentrífuga de bancada, remova o sobrenadante e reponha com PBS 1x no volume original. Repita este processo para lavar as microesferas duas vezes.
  4. Prepare uma suspensão para gavagem contendo 0,25% de microesferas (diluição 1:10 da suspensão estoque)/PBS 1x/0,05% de vermelho de fenol. Há cerca de 2,6x103 microesferas no volume de gavagem de 4,6 nl administrado por larva.
  5. Utilize o protocolo da seção 3 para realizar a gavagem do número desejado de larvas. As microesferas são parcialmente flutuantes; portanto, a gavagem deve ser realizada o mais rapidamente possível para maximizar a consistência da suspensão.
  6. Neste experimento, 15 larvas foram submetidas à gavagem e mantidas posteriormente em poços individuais de uma placa de 12 poços após a recuperação da anestesia, a fim de acompanhar o trânsito em indivíduos. No entanto, grupos maiores também podem ser submetidos à gavagem e o trânsito pode ser avaliado como uma população, em vez de individualmente. Consulte Field et al. para práticas padrão26.
  7. Avalie a motilidade intestinal pontuando a localização mais rostral (ou anterior) das microesferas fluorescentes em larvas vivas em diferentes momentos, utilizando um estereomicroscópio de fluorescência. Anestesie brevemente as larvas em tricaina 1x (0,017%) e pontue as zonas de localização das microesferas ou capture imagens para pontuação posterior.
  8. Represente graficamente e compare a porcentagem de larvas totais com microesferas em uma determinada região intestinal ao longo do tempo.

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Resultados

Quando a gavagem é realizada corretamente, o material administrado deve estar inteiramente contido no intestino anterior, com pouco ou nenhum resíduo no esôfago (Figura 3). Deve-se escolher um volume de administração que possa ser acomodado dentro do bulbo anterior e que não vaze pela cloaca ou pelo esôfago. Se o volume do material ou a pressão de administração forem excessivos, a força física da gavagem poderá causar danos ou vazamento através do epitélio. Também poderá expelir ou alterar outros compone...

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Discussão

Neste trabalho, descrevemos um novo protocolo para a entrega direta de materiais ao intestino de larvas de peixe-zebra por meio de microsondagem. Existem várias etapas críticas ao longo do procedimento que devem ser levadas em consideração. Primeiramente, as larvas de peixe-zebra devem estar em boas condições de saúde antes do experimento de sondagem, a fim de prevenir mortes não relacionadas ao tratamento. Outro fator importante é a qualidade da agulha de sondagem. Uma das partes mais difíceis do protocolo é cortar a ag...

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Divulgações

Nenhum conflito de interesses declarado.

Agradecimentos

Agradecemos aos membros do laboratório de Rawls pelas sugestões úteis sobre o conteúdo e ao Dr. Alan Fanning pelas valiosas discussões sobre permeabilidade de tamanho e métodos de disruptura das junções íntimas. Agradecemos também ao Dr. Michael Chua e ao Dr. Neal Kramarcy da Michael Hooker Microscopy Facility pelo apoio com o microscópio confocal. Este trabalho foi apoiado por subsídios dos National Institutes of Health T32 DK007737-15 (bolsista J.L.C.), F32 DK094592 (para J.L.C.) e R01 DK081426 (para J.F.R.).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Finquel (metanosulfonato de tricaina)Argent Chemical LaboratoriesMS-222Anestesia de larvas
Solução de vermelho de fenolSigma-AldrichP0290-100 ml0,5% em DPBS, testado para cultura celular
Óleo mineral, leve, branco (alta pureza)AmrescoJ217-500 mlPara reenchimento da agulha e teste de volume
Dextrano TxRed, peso molecular 10.000, fixável por lisinaInvitrogen/ Molecular ProbesD-1863Suspensão a 1% em PBS 1x/vermelho de fenol
FM4-64FXInvitrogen/ Molecular ProbesF34653Estoque a 5 mM em água
MetilceluloseMP Biochemicals0215549590
Capilares de vidro borossilicatoDrummond Scientific3-000-203-G/XDiâmetro externo 1,14 mm, diâmetro interno 0,53 mm, comprimento 3,5 polegadas
Forma plástica para fabricação de moldesAdaptive Science ToolsTU-1
Unidade de microinjeção Nanoject IIDrummond Scientific3-000-204
Puxador de micropipetas Flaming Brown, filamento largo de 3,0 mmSutter Instrument Co.P-97, FT330BFabricação de agulhas
Pinça Dumont #5 para estudantesFine Science Tools91150-200,1 x 0,06 mm, corte de agulhas
Retículo ocular, 5 mm - 100 divisõesLeica10394771Corte de agulhas
MicroforjaNarishigeMF-900Corte de agulhas e polimento a fogo
Agulha para seringa Tuberculin SlipTipBecton Dickinson3096261 ml, agulha 25G 5/8
Microesferas Fluoresbrite YG (2,0 μm)Polysciences, Inc.18338Análise da motilidade intestinal
Microsscópio estereoscópicoLeicaS6EProcedimento de gavagem
Microsscópio estereoscópico de fluorescênciaLeicaM205CEnsaio de barreira com dextrano
Microscópio confocalZeissLSM510Imagem do dextrano na circulação

Referências

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