A administração intranasal de Terapêutica do SNC para Ratos Awake

Leah R. Hanson; Jared M. Fine; Aleta L. Svitak; Katherine A. Faltesek

doi:10.3791/4440

É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

A administração intranasal de Terapêutica do SNC para Ratos Awake

61.7K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/4440

⸱

8 de abril de 2013

Leah R. Hanson¹ , Jared M. Fine¹ , Aleta L. Svitak¹ , Katherine A. Faltesek¹

¹Alzheimer’s Research Center at Region’s Hospital, HealthPartners Institute for Education and Research

Neste artigo

Resumo

Um método para administrar medicamentos por via intranasal aos ratinhos acordado para o objectivo de atingir o cérebro é descrito. Este método permite doses repetidas durante longos períodos, utilizando a administração intranasal de droga sem anestesia, e nariz ao cérebro de entrega com a exposição sistémica mínima.

Resumo

A administração intranasal é um método de administração de agentes terapêuticos ao sistema nervoso central (SNC). É não-invasiva e permite que as moléculas grandes que não atravessam o acesso barreira sangue-cérebro para o SNC. Drogas são diretamente direcionados para o SNC com a administração intranasal, reduzindo a exposição sistêmica e, portanto, indesejáveis efeitos colaterais sistêmicos ^1. Entrega do nariz para o SNC ocorre dentro de minutos ao longo de ambas as vias olfativas e trigeminais neurais através de uma via extracelular e não necessita de fármaco para se ligar a qualquer receptor ou o transporte axonal ^2. A administração intranasal é um método amplamente divulgado e está sendo usado em testes clínicos em humanos ^3.

A administração intranasal de drogas em modelos animais permite a avaliação inicial de distribuição farmacocinética e eficácia. Com ratos, é possível a administração de drogas para animais acordados (não-anestesiados) numa base regular usando uma especializaçãozou aderência intranasal. Entrega acordado é benéfico, pois permite que a longo prazo a administração crónica sem anestesia, leva menos tempo do que com a anestesia, e pode ser aprendido e feito por muitas pessoas para que as equipes de técnicos números podem grande dose de camundongos em períodos curtos. A eficácia de terapêuticas administradas por via intranasal, desta forma a ratinhos tem sido demonstrada em vários estudos, incluindo insulina em modelos de ratos diabéticos ^4-6 e deferoxamina em modelos de ratinho de Alzheimer ^7,8.

O aperto intranasal para ratos pode ser aprendido, mas não é fácil e requer prática, habilidade e um aperto preciso de efetivamente entregar drogas para o cérebro e evitar a drenagem para o pulmão e o estômago. Os ratinhos são restringidos à mão usando um scruff modificado na mão não-dominante com o gargalo realizada paralela ao chão, enquanto medicamento é fornecida com uma pipeta utilizando a mão dominante. Ele normalmente leva 3-4 semanas de aclimatação antes de lidar com ratospode ser realizada com este aperto sem uma resposta ao estresse. Nós preparamos este vídeo JoVE para fazer esta técnica administração intranasal mais acessível.

Protocolo

1. Aclimatação a manipulação para administração intranasal de Ratos Awake

Introdução

Mice devem ser aclimatados a manipulação por um período de 2-4 semanas antes do início da administração intranasal. Aclimatação a manipulação é importante, pois ajuda a garantir uma posição correta do corpo para a eficácia máxima de entrega de drogas acordado intranasal. Além disso, os ratos que não tenham sido adequadamente acostumados a esse processo pode ter uma reacção grave ansiedade após a administração. Mice deve passar de cerca de 2-3 dias em cada uma das nove passos antes de avançar para o passo seguinte, dependendo de conforto do animal para o manuseamento. O nível de tensão do rato deverá ser utilizado como uma medida do progresso. Isso significa controlar os movimentos do mouse, a quantidade / freqüência de defecação, micção, tremendo, e morder. Se um mouse tem uma resposta de estresse elevado, permanecer nessa etapa antes de avançar para o próximo até que a resposta é reduzido. Uma amostra de aclimatação schedule pode ser visto na Tabela 1. Aclimatação dos ratinhos devem progredir através dos seguintes de uma vez por dia etapas. Executar estes passos mais do que uma vez por dia, em uma tentativa de acelerar a adaptação, não é recomendado.

Colocar o rato na palma da mão durante um período de dois a três minutos, não mais do que um pé acima da parte superior da gaiola, os animais frequentemente saltar durante este passo de introdução. Se o rato tenta rastejar para fora da mão e até um braço, basta levantar o mouse pela base da cauda e colocá-lo de volta na mão.
Posicione o mouse na palma da mão por três minutos e pet o animal delicadamente. Pet o mouse direcional da cabeça à cauda, enquanto permite que o animal se movimentar livremente.
Colocar o rato na palma da mão durante três minutos enquanto massageia atrás das orelhas (levemente beliscar juntos a pele na parte de trás do pescoço, utilizando o polegar e o dedo indicador).
Segure / lipé o mouse pela nuca de seu pescoço por 30 segundos, deixando o resto do mouse no topo de gaiola por 30 segundos antes de repetir o porão novamente.
Segure o mouse usando a alça intranasal, que é descrito na seção 2, mas não inverter o animal (completar até o passo 2.4). Segure o animal como este por um período de 30 segundos e solte volta para o topo da gaiola. Repita uma segunda vez, após um período de descanso de um minuto.
Segure o mouse com o aperto intranasal como descrito na seção 2, incluindo o animal invertendo assim o seu lado ventral é voltado para cima em direção ao teto. Certifique-se de que o pescoço do animal é paralelo ao chão. Mantenha essa posição por 30 segundos. Repita esta uma segunda vez, após um período de descanso de um minuto. Alguns ratos irá resistir a aderência intranasal mais do que os outros, especialmente quando usado pela primeira vez, com inversão no passo na aclimatação. Se o rato se livra das garras, coloque o mouse de volta no topo de gaiola e re-aperto. Repita o re-aperto, se necessário, Mas monitorar o nível de estresse do mouse e devolvê-lo para a jaula, se necessário. Outro factor que pode desempenhar um papel na perda da aderência, neste ponto do processo de aclimatação é inexperiência dos tratadores de animais com a técnica de entrega intranasal.
Segure o mouse com o aperto intranasal, inverter, momentaneamente colocar uma pipeta com uma ponta de vazio em cada narina, e mantenha a posição por 30 segundos animais. Repita este depois de um período de descanso de um minuto.
Segure o mouse com o aperto intranasal, invertê-lo, e por via intranasal administrar 6 ul de solução salina no nare esquerda e direita, como descrito na seção 3 (até a etapa 3.7).
Segurar o rato com o aperto intranasal, invertê-lo, e intranasal administrar 6 ul de solução salina no nare esquerda e para a direita duas vezes colocando o animal de volta no topo de gaiola no meio, como descrito na secção 3.

2. O Punho intranasal para imobilizar Ratos Awake

Coloque o rato on superior da gaiola.
Com o polegar eo dedo indicador de sua mão dominante, segure o mouse pela cauda. Usando o seu meio, anel, e os dedos mindinho, levemente fixar a porção inferior do corpo para o topo da gaiola (Figura 1A). Vamos pegar o mouse sobre as barras que você levemente esticar o mouse para fora e melhor pegar a nuca.
Usando o polegar eo dedo médio da sua mão não-dominante, aperte o mouse firmemente na nuca (excesso de pele) por trás do pescoço e ombros. Puxe a pele frouxa para fazer uma tenda de pele entre as omoplatas (Figura 1B). Tire a pele tanto quanto possível, mas tenha cuidado para não puxar o músculo como isso irá causar desconforto para o mouse. Tenha cuidado para não aplicar muita pressão para caixa torácica do animal ou da coluna vertebral. A pressão excessiva ou puxar da pele pode conduzir à inibição da respiração, em alguns casos.
Rapidamente coloque o dedo indicador de sua mão não-dominante na cabeça do rato comoperto do nariz quanto possível e puxe a pele (Figura 1C, 1D). Ao mesmo tempo, deslize o polegar e os dedos médios em direção à cabeça para a posição ideal. Idealmente, o rato não deve ser capaz de mover a sua cabeça na vertical ou na horizontal.
Apesar de manter o controle sobre a nuca, vire o mouse sobre as costas. Trás do rato deve estar na palma da sua mão. Segure firmemente a cauda do rato (perto da base) contra a palma da mão com os últimos dois dedos (anel e mindinho) para estabilizar o mouse, ou você pode envolver seus dedos pela parte inferior do corpo (Figura 1E, 1F).
Neste ponto, certifique-se de que o pescoço do rato e do queixo são planos e paralelos ao chão. O queixo deve ser próximo de um ângulo de 180 graus, com o gargalo, tanto quanto possível, para ajudar com a administração intranasal. Pequenas alterações na inclinação, pode fazer com que o medicamento para acabar no sítio errado. Verifique se o mouse é capaz de respirar por assistir o abdômen. O sho do mouseuld não ser capaz de se mover, mas deve ser confortável e não em qualquer dor. Se você ver o pescoço do rato e do queixo fazendo um "V", então você precisa re-aperto.

3. Entrega intranasal de Drogas para Ratos Awake

Introdução

Usando o aperto intranasal, cada rato é restringida por duas vezes e mantido com o seu pescoço paralelo ao chão enquanto um volume de 20-30 uL de líquido é administrado. Este volume é seguro e eficaz para os pequenos-grandes ratos, nós normalmente usam 24 ul, e que é descrito neste protocolo. O método acordado intranasal podem ser utilizados em ratinhos de todas as idades, por exemplo, em ratos recém-nascidos para a pesquisa de desenvolvimento neuroscience. Em ratos recém-nascidos, um menor volume total (8 uL) e o tamanho das gotas (1 ul) deve ser utilizado para acomodar o menor volume da cavidade nasal. Droga é normalmente entregue a dois ratos de cada vez, alternando os períodos de repouso para permitir a utilização mais eficaz do tempo e manter ocronograma de n. Set-up vai ser um pouco diferente dependendo se você estiver dosagem ratos alojados em grupo ou ratos alojados individualmente. Com os ratos alojados individualmente, é útil para colocar todos os seus materiais entre as gaiolas para evitar que ratos de cruzar para o topo outra gaiola. Com o grupo de ratos alojados dose, desde que somente gaiola. É importante que cada rato numa gaiola alojados em grupo recebe o mesmo tratamento intranasal, como o potencial de contaminação cruzada de dois tratamentos diferentes existe devido à expulsão de drogas para o ar ou com o contacto com a pele. É altamente recomendável que uma folha de dosagem ser impresso com antecedência, para lembrar os técnicos de trabalhos de tratamento, para registrar todas as notas de gotas perdidas, a nota geral de saúde de cada animal, etc

Passos

Configure jaulas onde eles deveriam estar para a dosagem, e montou uma estação de dosagem (Figura 2).
Retire do mouse de gaiola e manter em cima da gaiola durante a dosagem.
Pegue o mouse usando o aperto intranasal descrito na seção 2.
Usando sua mão dominante, carregar o pipetador com 6 ul de droga ou veículo. Colocar a ponta da pipeta a cheio perto narina esquerda do rato, geralmente a um ângulo de 45 graus (Figura 1G, 1H). Se você tiver uma solução viscosa que você pode precisar de aumentar o seu ângulo de 90 graus, porque a droga pode correr até o lado da ponta da pipeta em vez de fazer uma gota. Se muito viscoso, limpando a ponta da pipeta com um lenço antes de expelir líquido pode ajudar. Lentamente ejectar a droga para formar uma pequena gota com cerca de metade do volume (3 ul).
A gotícula deve ser colocado suficientemente perto narina do rato de modo que o rato pode inalar a gota. Imediatamente após o rato inala esta pequena gota, ejectar o resto do medicamento na ponta da pipeta de modo a formar uma outra gotícula pequeno para o rato a inalar através da narina mesmo cerca de 2-3 segundos depois. Não deixe de ver a boca. Se há is qualquer líquido na boca, a queda não torná-lo totalmente no nariz e isso deve ser observado.
Segure o mouse nesta posição por 15 segundos. É altamente recomendável que um temporizador ser usado para padronizar esta espera 15 seg.
Repita os passos de 3,3-3,6 para a narina direita. Se as gotas são bufou fora, que a queda deve ser substituído e anotados.
Posicione o mouse de volta ao topo de sua gaiola por 2 min. Repita o processo inteiro a partir de 2 min. após a entrega da primeira queda. Isto dá o rato quatro gotas de 6 ul de cada, totalizando 24 jul de solução. Uma programação de dosagem de amostra para um ou dois ratos de uma só vez pode ser visto na Tabela 2.
Depois de o rato recebeu todas as gotas, devolva o mouse para sua gaiola.

4. Técnicas de Manuseio de animais gerais para Aclimatação e administração intranasal de droga para Ratos Awake

Após cada sessão de aclimatação ou administração intranasal, os murganhos devem darnd tratar, tal como uma Cheerio ou semente de girassol descascada, como reforço positivo. Guloseimas são dadas como recompensa e para distraí-los de coçar o nariz, que pode causar ferimentos a si mesmos. Ao trabalhar com ratos alojados em grupo, trata suficientes devem ser descartados para cada rato. Antes de regressar às suas gaiolas animais não deixe de restaurar ninhos para os seus estados originais, a fim de reduzir o stress. No doseamento de animais alojados em grupo, as luvas devem ser mudadas entre a dosagem de gaiolas de modo a não transferir aroma de colónia para colónia gaiola gaiola, uma vez que irá tornar-se agressivo para o outro.