Descrita é um processo de rotulagem em duas etapas usando β-glicosiltransferase (β-GT) para transferir uma azida de glucose para 5 HMC, seguido por química do clique para transferir de um ligante de biotina para o enriquecimento fácil e densidade independente. Este método de marcação eficiente e específico permite o enriquecimento de 5 HMC com fundo extremamente baixo e de alto rendimento de mapeamento epigenômico via sequenciamento de última geração.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Captura selectivo de 5-hydroxymethylcytosine a partir de DNA genómico
Neste artigo
Resumo
Resumo
5-metilcitosina (5-mC) constitui ~ 2-8% das citosinas totais no DNA genómico humano e um impacto de uma ampla gama de funções biológicas, incluindo a expressão de genes, a manutenção da integridade do genoma, a impressão parental, inactivação do cromossoma X, a regulação dos desenvolvimento, envelhecimento, cancro e 1. Recentemente, na presença de um oxidado 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5 HMC), foi descoberto em células de mamíferos, em particular no estaminais embrionárias (ES) e células neuronais 2-4. 5 HMC é gerado por oxidação de 5-mC catalisada por TET família de ferro (II) / α-cetoglutarato-dependente dioxigenases 2, 3. 5 HMC é proposto para ser envolvido na manutenção de células estaminais embrionárias (MES), a hematopoiese normal e doenças malignas, e o desenvolvimento do zigoto 2, 5-10. Para melhor compreender a função da 5-HMC, um sistema de sequenciação fiável e simples é essencial. Seqüenciamento bissulfito tradicional não pode distinguir 5 HMC de 5-MC 11 12.
Aqui descrevemos um procedimento em duas etapas simples para rotulagem química seletiva de 5-HMC. No passo de rotulagem em primeiro lugar, 5 HMC em ADN genómico é marcado com um catalisada 6-azida-glucose por β-GT, uma glicosiltransferase de bacteriófago T4, de uma maneira que transmite a 6-azida-glucose a 5 HMC do cofactor modificado, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). No segundo passo, biotinilação, de um ligante de biotina de dissulfureto é ligado ao grupo azida por química do clique. Ambos os passos são altamente específicos e eficiente, levando à completa marcação, independentemente da abundância de 5 HMC em regiões genómicas e dando de fundo extremamente baixos. Seguindo a biotinilação de 5 HMC, os fragmentos de 5 HMC contendo ADN são então selectivamente capturadautilizando contas de estreptavidina de um modo independente de densidade. Os fragmentos resultantes de 5 HMC enriquecidas de DNA pode ser utilizado para as análises a jusante, incluindo a última geração de sequenciação.
Nossa marcação selectiva e protocolo de captura confere alta sensibilidade, aplicável a qualquer fonte de DNA genômico com variáveis / diverso 5 HMC-abundâncias. Embora o objetivo principal deste protocolo é a sua aplicação a jusante (ou seja., Sequenciamento de última geração para mapear a distribuição de 5 HMC no genoma), é compatível com molécula única, em tempo real SMRT (DNA) de seqüenciamento, que é capaz de fornecer uma única base de sequenciação de resolução de 5 HMC.
Protocolo
1. A fragmentação de ADN genómico
Fragmento de ADN genómico utilizando sonicação de uma gama de tamanhos desejada adequada para a plataforma de sequenciamento do genoma. (Nós normalmente sonicar a ~ 300 pb.) Verificar a distribuição do tamanho do ADN genómico fragmentado em 1% de gel de agarose (Figura 1).
2. Preparação de ADN
Determinar as quantidades de ADN a partir baseadas na abundância de 5 HMC em ADN genómico. Desde 5-HMC níveis variam significativamente em diferentes tipos de tecidos, quantidades de DNA a partir dependem dos níveis de 5-HMC das amostras. Por favor, consulte a Tabela 1 para exemplos.
3. β-GT reacção catalisada (reacção de transferência de Glicose)
- Misturar por pipetagem da mistura, como detalhado na Tabela 2 e incuba-se em um banho de água a 37 ° C durante 1 h.
- Após a incubação, limpar-se a mistura reaccional com remoção Kit QIAquick Nucleotide, utilizando 10 jig de DNA porcoluna. Eluir com 30 ul de água por coluna e combinar.
4. Reação Biotinilação (Clique Química)
- Adicionar DBCO-SS-PEG3-biotina conjugado de solução de trabalho (1 mM) na solução de ADN eluído (do passo 3) para uma concentração final de 150 uM (ou seja, 5 uL de solução de trabalho por 30 ul de solução de ADN).
- Misturar por pipetagem, e incubar em banho de água a 37 ° C durante 2 horas.
- Limpe a reação com QIAquick Removal Kit Nucleotide. O volume de eluição total ideal é de 100 uL.
- Quantificar a quantidade de DNA recuperado usando microlitro espectrofotômetro escala (por exemplo., NanoDrop).
5. Captura de 5 HMC contendo DNA
- Lave 50 ul de Dynabeads MyOne Estreptavidina C1 3 vezes com 1 ml de 1X tampão B & W de acordo com as instruções do fabricante. Separa-se as pérolas com um suporte magnético.
- Adicionar um volume igual de 2X tampão B & W para o D recuperado biotiniladoNA (100 ul) às pérolas lavadas.
- Incubar durante 15 min à temperatura ambiente com rotação suave num agitador rotativo.
- Separa-se as pérolas com um suporte magnético e lavar as pérolas três vezes com 1 ml de 1X tampão B & W.
- Eluir o DNA através da incubação as pérolas em 100 ul de DTT mM preparada de fresco 50 durante 2 h à temperatura ambiente, com rotação suave num agitador rotativo.
- Separa-se as pérolas com um suporte magnético. Aspirar o eluente e uma carga para Micro Bio-Spin 6 Coluna de acordo com a instrução de fabrico para remover o DTT. O ADN alvo é a solução agora.
- Purifica-se o DNA eluído a partir do passo anterior, Qiagen Purification Kit MinElute PCR DNA e elui-se em 10 ul de tampão EB. Quantificar DNA usando Fluorometer Qubit ou NanoDrop se a concentração é superior a 20 ng / ul. O DNA está pronto para jusante preparação biblioteca genômica sequenciação.
6. Resultados representativos
Se a qualidade de of DNA genómico é elevada, o rendimento de recuperação típicos após a β-GT e reacções de biotinilação são ~ 60-70%. No entanto, a eficiência da captação variar significativamente com os tipos de tecidos diferentes, dependendo dos níveis de 5-HMC das amostras. Normalmente, a eficiência da captação de DNA genómico cérebro é ~% 4-9, e, em alguns casos extremos, a eficiência pode atingir até 12%. No caso de células ES, a eficiência da captação média é de aproximadamente 2-4%, em contraste com a ~ 0,5% para as células estaminais neurais. A menor eficiência visto até agora foi para o DNA genômico de células cancerosas. Todos DNA enriquecido está pronto para o padrão da próxima geração de protocolos de preparação de bibliotecas. Além disso, o ADN capturado pode também ser usado como molde para a PCR em tempo real para detectar o enriquecimento de alguns fragmentos em comparação com o ADN de entrada, se os iniciadores relacionados estão disponíveis.
Figura 1. Sonicados fragmentos genómicos humanos de DNA em1% de gel de agarose. De 10 ug de DNA genómico isolado a partir de células humanas do iPS em 120 ul de tampão TE 1X foi sonicada usando um dispositivo de ultra-sons (Covaris). Após sonicação, 2 ul do DNA sonicado foi carregada num gel de agarose a 1% utilizando 100 pb do marcador de DNA para comparar os tamanhos dos fragmentos de DNA sonicados.
| Componente | Volume | Concentração Final |
| Água | _ Ul | |
| 10 X tampão de reacção β-GT | 2 ul | 1 X |
| Até 10 ug de ADN genómico | _ Ul | Até 500 ng / uL |
| UDP-N-6, 3-Glc (3 mM) | 0,67 ul | 100 uM |
| β-GT (40 uM) | 1 ul | 2 uM |
| Volume total | 20 ul |
i) Para o DNA genômico de tecidos (conteúdo 5 HMC alta> 0,1%)
| Componente | Volume | Concentração Final |
| Água | _ Ul | |
| 10 X tampão de reacção β-GT | 10 ul | 1 X |
| Até 20 ug de ADN genómico | _ Ul | Até 500 ng / uL |
| UDP-6-N3-Glc (3 mM) | Ul 1,33 | 100 uM |
| β-GT (40 uM) | 2 ul | 2 uM |
| Volume total | 40 ul |
ii) Para o ADN genómico de células estaminais (mediana 5 HMC conteúdo ~ 0,05%)
| Componente | Volume | Concentração Final |
| Água | _ Ul | |
| 10 X tampão de reacção β-GT | 10 ul | 1 X |
| Até 50 ug de ADN genómico | _ Ul | Até 500 ng / uL |
| UDP-6-N3-Glc (3 mM) | 3,33 ul | 100 uM |
| β-GT (40 uM) | 5 ul | 2 uM |
| Volume total | 100 ul |
iii) Para o câncer de DNA genômico de células (conteúdo 5 HMC baixo ~ 0,01%)
Tabela 1. Exemplos de quantidades de ADN de entrada e de reacções de etiquetagem utilizando as amostras com diferentes níveis de HMC-5 através do método selectivo química rotulagem.
| Amostra | 5 HMC nível | ADN de partida (mg) | A recuperação após a etiquetagem (entrada de esferas) (ig) | Rendimento de recuperação | Pull-down DNA (ng) | Puxe para baixo rendimento |
| Cerebelo do rato adulto | 0,4% | 10 | 7,5 | 75% | 236 | 3,1% |
| Pós-natal do rato 7 dias cerebelo | 0,1% | 11 | 9 | 82% | 140 | 1,6% |
| Rato de células ES E14 | 0,05% | 60 | 42 | 70% | 350 | 0,8% |
Tabela 2. Resultados representativos a partir de tecidos e células do cérebro de rato ES.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
5-hydroxymethylcytosine (5 HMC) é uma modificação do presente recentemente identificado epigenética em quantidades substanciais em certos tipos de células de mamíferos. O método aqui apresentado é para determinar a distribuição de todo o genoma de 5 HMC. Usamos bacteriófago T4 β-glicosiltransferase para transferir uma porção glucose engenharia contendo um grupo azida para o grupo hidroxilo de 5 HMC. O grupo azida pode ser quimicamente modificados com biotina para a detecção, o enriquecimento por afinidade, e sequenciame...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Este estudo foi financiado em parte pelo Instituto Nacional de Saúde (GM071440 a CH e NS051630/MH076090/MH078972 para PJ).
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome | Companhia | Catalogo | Comentário |
| Reagentes | |||
| O cloreto de sódio 5 M (NaCl) | Promega | V4221 | |
| PH 8,0 0,5 M de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) | Promega | V4231 | |
| 1M Trizma base (Tris) pH 7,5 | Invitrogen | 15567-027) | |
| HEPES 1M, pH 7,4 | Invitrogen | 15630 | |
| Cloreto de magnésio (MgCl2) 1M | Ambion | AM9530g | |
| Dimetil-sulfóxido (DMSO) | Sigma | D8418 | |
| Tween 20 | Fisher biorreagentes | BP337-100 | |
| DBCO-SS-PEG3-biotina conjugado | Clique em Ferramentas Química | A112P3 | |
| 1,4-Ditiotreitol, ultrapura (TDT) suprapuro | Invitrogen | 15508-013 | |
| QIAquick Removal Kit Nucleotide | Qiagen | 28304 | |
| Micro Bio-Spin 6 Coluna | Bio-Rad | 732-6222 | |
| Dynabeads MyOne | Invitrogen | 650-01 | |
| Estreptavidina C1 | |||
| Qiagen MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| UDP-6-N 3-glucose | Motivo ativa | 55013 | |
| Enzima | |||
| β-glicosiltransferase (β-GT) | New England Biolab | M0357 | |
| Equipamento | |||
| Dispositivo sonicação | Covaris | ||
| Centrífuga de mesa | |||
| Banho de água | Fisher Scientific | ||
| Aparelho de gel de corrida | Bio-Rad | ||
| NanoDrop1000 | Thermo Scientific | ||
| Labquake Tubo Shaker | Barnstead | ||
| Labquake Tubo Shaker | Thermolyne | ||
| Suporte de Separação Magnética | Promega | Z5342 | |
| Qubit 2,0 Fluorometer | Invitrogen | ||
| Configuração de reagente 10 X Reacção β-GT tampão (500 mM de HEPES pH 7,9, 250 mM de MgCl 2) 2 X de ligação e de lavagem (B & W) de tampão (10 mM Tris pH 7,5, EDTA 1 mM, NaCl 2 M, Tween a 0,02% 20) . |
Referências
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat. Genet. , Suppl 33. 245-254 (2003).
- Ito, S. Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification. Nature. 466, 1129-1133 (2010).
- Tahiliani, M. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
- Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324, 929-930 (2009).
- Ko, M. Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2. Nature. 468, 839-843 (2010).
- Koh, K. P. Tet1 and tet2 regulate 5-hydroxymethylcytosine production and cell lineage specification in mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 8, 200-213 (2011).
- Iqbal, K., Jin, S. G., Pfeifer, G. P., Szabo, P. E. Reprogramming of the paternal genome upon fertilization involves genome-wide oxidation of 5-methylcytosine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 3642-3647 (2011).
- Wossidlo, M. 5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming. Nat. Commun. 2, 241(2011).
- Gu, T. P. The role of Tet3 DNA dioxygenase in epigenetic reprogramming by oocytes. Nature. 477, 606-610 (2011).
- Dawlaty, M. M. Tet1 is dispensable for maintaining pluripotency and its loss is compatible with embryonic and postnatal development. Cell Stem Cell. 9, 166-175 (2011).
- Huang, Y. The behaviour of 5-hydroxymethylcytosine in bisulfite sequencing. PLoS One. 5, e8888(2010).
- Song, C. X. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nat. Biotechnol. 29, 68-72 (2011).
- Pastor, W. A. Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells. Nature. 473, 394-397 (2011).
- Matarese, F., Pau, C. arrillo-deS. anta, E,, Stunnenberg, H. G. 5-Hydroxymethylcytosine: a new kid on the epigenetic block. Mol. Syst. Biol. 7, 562(2011).
- Szwagierczak, A., Bultmann, S., Schmidt, C. S., Spada, F., Leonhardt, H. Sensitive enzymatic quantification of 5-hydroxymethylcytosine in genomic DNA. Nucleic Acids Res. 38, 181(2010).
- Terragni, J., Bitinaite, J., Zheng, Y., Pradhan, S. Biochemical characterization of recombinant β-glucosyltransferase and analysis of global 5-hydroxymethylcytosine in unique genomes. Biochemistry. , (2012).
- Rusmintratip, V., Sowers, L. C. An unexpectedly high excision capacity for mispaired 5-hydroxymethyluracil in human cell extracts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14183-14187 (2000).
- Globisch, D. Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates. PLoS One. 5, e15367(2010).
- Yildirim, O. Mbd3/NURD Complex Regulates Expression of 5-Hydroxymethylcytosine Marked Genes in Embryonic Stem Cells. Cell. 147, 1498-1510 (2011).
- Szulwach, K. E. Integrating 5-hydroxymethylcytosine into the epigenomic landscape of human embryonic stem cells. PLoS Genet. 7, e1002154(2011).
- Szulwach, K. E. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nat. Neurosci. 14, 1607-1616 (2011).
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
