Enriquecimento de série-tronco de esperma e células progenitoras (SSC) em Cultura para Derivação de longo prazo Adultos Linhas rato SSC

Resumo

Um método simples para obter e manter a haste espermatogónias e linhas de células progenitoras a partir de ratos adultos, é aqui apresentada. O método utiliza células de alimentação provenientes do compartimento de células somáticas do testículo do rato adulto. Esta técnica é aplicável a linhagens de camundongos comuns, incluindo transgênico, knock-out, e bater-nos camundongos.

Resumo

Tronco espermatogônias e as células progenitoras (SSCS) dos testículos representam um exemplo clássico de células-tronco adultas de mamíferos e preservar a fertilidade por quase toda a vida do do animal. Embora os mecanismos precisos que controlam a auto-renovação e diferenciação in vivo são difíceis de estudo, vários sistemas têm sido desenvolvidos anteriormente para propagar SSC murinos in vitro, utilizando uma combinação de meios de cultura e as células especializadas do alimentador ^1-3.

Mais em incursões in vitro sobre a biologia do SSC ter derivado de linhas celulares a partir de recém-nascidos, possivelmente devido à dificuldade na obtenção de linhas de células adultas ^4. No entanto, os testículos continua a amadurecer-se até ~ 5 semanas de idade na maioria das estirpes de ratinho. No período pós-natal precoce, mudanças drásticas ocorrem na arquitectura dos testículos e na biologia de ambos células somáticas e de espermatogénese, incluindo alterações nos níveis de expressão de células estaminais numerosos relacionadagenes. Portanto, as linhas-neonatal derivados SSC não pode inteiramente recapitular a biologia do SSC adultos que persistem após o testículo adulto chegou a um estado estacionário.

Vários fatores têm dificultado a produção de linhas de adultos SSC historicamente. Em primeiro lugar, a proporção de células-tronco funcionais pode diminuir durante a idade adulta, quer devido a factores intrínsecos ou extrínsecos ^5,6. Além disso, como com outras células-tronco adultas, tem sido difícil para enriquecer suficientemente SSC a partir de células adultas totais testiculares sem o uso de uma combinação de estratégias de triagem ou imuno outros ^7. Estratégias geralmente utilizadas incluem a utilização de ratinhos criptorquídios como uma fonte de células do doador, devido a uma maior proporção de células estaminais para outros tipos de células ^8. Com base na hipótese de que a remoção de células somáticas a partir da cultura inicial perturba as interacções com o nicho de células estaminais que são essenciais para a sobrevivência SSC, que anteriormente desenvolvidos métodos para derivar l adultoines que não necessitam de imuno ou doadores criptorquídios mas sim empregar enriquecimento série de SSC em cultura, a seguir referido como SESC ^2,3.

O método descrito a seguir envolve um procedimento simples para derivar linhas adultos SSC, dissociando adulto dador túbulos seminíferos, seguido por plaqueamento das células em alimentadores que compreendem uma linha celular de estroma testicular (JK1) ^3. Através de série passagem, fortemente aderente, contaminando germinativas células não estão esgotados a partir da cultura de enriquecimento concomitante de SSC. Culturas produzidas desta forma contém uma mistura de espermatogônias em diferentes estágios de diferenciação, as quais contêm, com base em SSC a longo prazo a capacidade auto-renovação. O cerne do método SESC é que ele permite SSC para fazer a transição difícil de auto-renovação in vivo a longo prazo de auto-renovação in vitro num microambiente radicalmente diferente, produz linhas de longo prazo do CCD, livre de contaminaçãocélulas somáticas, e desse modo permite a manipulação experimental subsequente de SSC.

Protocolo

1. Preparação de células de alimentação

Note-se que todos os reagentes descritos em seguida devem ser preparadas de forma estéril (ver Tabelas 1 e 2). Este protocolo utiliza a linha celular de JK1 (Cell Biolabs, Inc., catálogo # CBA-315) como alimentadores, que é um derivado de transformada de rato adulto células testiculares somáticas e foi descrito em outro lugar ^3. Note-se também que todos os procedimentos com animais deve ser realizado de acordo com as diretrizes institucionais e regulamentos.

1. JK1 células podem ser mantidas em cultura e utilizadas com sucesso como alimentadores-se a passagem 39. Cultura JK1 células em uma placa de cultura de 100 milímetros de células (BD Falcon, catálogo # 353003), com 10 ml de meio esterilizado por filtração alimentador de crescimento (DMEM, suplementado com 10% soro fetal de bovino [FBS], 2 mM L-glutamina e antibióticos). Quando a cultura atinge 95% de confluência, as células divididas 1:06 -1:10 ratio.
2. Remova o meio de confluente mono célula JK1 alimentadorcamada.
3. Lavar camada de células uma vez com PBS sem cálcio e magnésio.
4. Adicionar pré-aquecido tripsina / EDTA, 1x (0,05% trypsin/0.53 mM EDTA; catálogo Corning Cellgro, # 25-051-CI), e incubar a 37 ° C durante 5-10 min.
5. Inactivar a tripsina com um volume igual de meio de crescimento do alimentador. Recolher as células e centrifugar a 300 xg durante 5 min. Re-suspender as células em meio de crescimento do alimentador.
6. Pré-revestimento de poços múltiplos placas de cultura de células por adição de 0,4% de solução suficiente para cobrir a gelatina bem e remover depois de 5 min à temperatura ambiente.
7. Placa ~ 250 células ^por mm2 em gelatina-revestido placa de cultura de células (por exemplo, formato de 48 poços ou de 6 poços). Incubar a cultura a 37 ° C durante 16 a 24 horas.
8. Remover o meio de cultura a partir de poços. CUIDADO: Para inactivar o crescimento celular, adicionar uma solução fresca de mitomicina-C a 10 ug / ml diluído em DMEM a cada poço (200 ul, por exemplo / poço de uma placa de 48 poços). A mitomicina-C é tóxico. Manuseie e descarte-a com cuidado. Incubar a37 ° C durante 4 horas.
9. Remover a mitomicina C-solução a partir de células. Lavar 3 vezes com DMEM antes de células-tronco do chapeamento.
10. Remover DMEM alimentador de células de poços e adicionar meio suficiente de células estaminais (100 ul / poço de uma placa de 48 poços, ver Tabela 3), para evitar a dessecação dos alimentadores durante passaging. Adicionar SSC mesmo dia, como descrito abaixo nas secções 3.1 e 3.4, utilizando os tamanhos indicados de poços contendo alimentadores.

2. Dissociação de Rato tecido testicular para obter células germinativas dos doadores

1. Colheita testículos adultos de mouse em forma estéril e armazenar temporariamente os testículos em uma placa de Petri coberta (sem qualquer líquido acrescentado). O prato tem colocado imediatamente em gelo para evitar a dessecação e manter a viabilidade celular.
2. Usando estéreis pinça fina e uma tesoura bem em uma capa de cultura de células, fazer uma incisão transversal na túnica albugínea sem completamente atravessa em testículos (ou seja, corte ~ ½ - ¾ distância through) e utilizar uma pinça para espremer para fora dos túbulos seminíferos em um canto da placa; túnica de descarte e tecido em anexo. Manter em gelo durante placa para manter o tecido refrigerados, mantendo assim a sua integridade e prevenir a evaporação.
3. Rapidamente mince túbulos com uma tesoura fina de mola, pelo menos, 3 minutos por testículo, mantendo placa em gelo.
4. Recolher os fragmentos dos túbulos num tubo cónico de 50 ml e lava-se em ~ 40 ml de soro de PBS / 1% de albumina bovina, refrigerada.
5. Centrifugar a 60 xg durante 10 minutos para separar os fragmentos dos túbulos de espermatozóides e detritos. Elimine o sobrenadante.
6. Num tubo cónico de 15 ml, ressuspender o sedimento em 3 ml por testículo de pré-aquecida tampão de dissociação (DMEM, 0,05% de tripsina, colagenase tipo I de 0,03%, 80% U / ml de DNAse I e 0,5 de albumina sérica bovina; Ver Tabela 2 para detalhes mais específicos de dissociação buffer).
7. Colocar o tubo cónico horizontalmente num suporte de um conjunto agitador a 150 rpm a 37 ° C durante 15 minutos para maximizar agitation.
8. Girar para baixo a 60 xg durante 10 minutos para separar as células individuais a partir de pedaços não dissolvidas.
9. Guardar os pedaços de pelotização contendo até a próxima etapa. Recolher o sobrenadante do passo 2.8 e adicionar 3 ml de DMEM/10% de soro fetal bovino para neutralizar tampão de dissociação. Coloque o tubo em gelo temporariamente.
10. Repetir o passo 2,6-2,7 com o pellet a partir do passo guardado 2,9 a re-digest pedaços restantes após a etapa 2.8.
11. Adicionar um volume igual de DMEM/10% de FBS para neutralizar tampão de dissociação.
12. Recombinam suspensão do passo 2,11 com suspensão de células guardadas a partir do passo 2.9. Centrifugar durante 5 minutos a 300 x g.
13. Ressuspender o granulado em meio de células estaminais em um volume de 16 ml por cada par de testículos (ver Tabela 3).

3. Chapeamento de suspensão de células de testículo

1. Placa 2 ml de suspensão de células por poço numa placa de 6 poços contendo células alimentadoras mitoticamente inactivadas com mitomicina-C-e o local de uma cultura de células de incubadora a 37 ° C em 5% de CO _2.
2. Depois de 48 horas de médio, aspirado, adicionar 2 ml de meio fresco e voltar a incubadora.
3. Após 48 horas, adicionar 0,5 ml de meio fresco de células estaminais a cada poço e voltar a incubadora.
4. Após 48 horas, em seguida alimentar as células três vezes por semana depois disso, como se segue, até grandes colónias discretas (> 50 células) aparece (dentro de 7 a 21 dias). Da primeira e segunda alimentação em cada semana (por exemplo segunda-feira e Sexta-Feira) remover aproximadamente 50% do meio e adiciona de volta a 50% em volume de meio fresco. Para uma alimentação terceiro (por exemplo, sexta-feira), aspirar todo o meio e substituir com 2 ml de meio fresco. Esta abordagem baseia-se no raciocínio de que evitar mudanças de meio completo minimiza as flutuações nas concentrações de sinais parácrinos que são secretadas para o meio de cultura de ^9.

4. Picking colônia de primeira passagem

1. Remover médio de colónias em poços contendo a ser passadas e adicionar meio fresco de células estaminais.
2. Identificar colônias usando uma objetiva de 10x. Com o microscópio ligeiramente de-concentrado, colónias SSC na borda do poço aparecerá como homogéneas aglomerações luminosas, compostas por muitas células de 11-12 um de diâmetro, em que é difícil ou impossível de distinguir as bordas das células individuais, uma vez que as células aparecem fundidos (Figura 1A). Não-SSC colônias pode parecer mais escuro, mais granular, ou menos homogêneo, com fronteiras discerníveis (Figura 1A, encarte).
3. Utilizando uma ponta de pipeta de 200 uL, com o conjunto de pipetteman de 50 ul, em primeiro tomar-se a partir do meio e assim expulsar para molhar a ponta. Em seguida, deslocar o suavemente com a ponta da colónia antes de retirar rapidamente 50 ul de meio para deslocar a colónia por aspiração para dentro da ponta (Figura 1B).
4. Expelir o meio contendo a colónia em um poço de uma placa de 48 poços contendo células alimentadoras inactivadas com 100 ul de meio de células estaminais (Figura 1C).
5. Repita o passo4,3 e adicionar até 8 colónias para o bem mesmo sem ultrapassar 500 ul por poço.
6. Repita os passos 4,3-4,5 para preparar poços da placa de 48 cavidades com colónias de passagem um CCD.
7. Wells estará pronto para dividir em 7-14 dias ou depois de grandes aglomerações de até 500 células surgiram (Figura 1D).

5. Expansão subseqüente e passaging de SSCs por trituração

1. Células de passagem deve ser subcultivados para alimentadores frescas após até 14 dias a uma razão de divisão de 1:2 para os primeiros três passagens e, em seguida, 01:04 - 01:06 (a cada 7 dias) depois disso, como se segue. Triturar suavemente colónias fora de um poço semi-confluentes (por exemplo, ~ 300.000 SSC / poço de placa de 6 poços), com uma ponta de pipeta ml por meio de lavagem através das células. As colónias podem ser vistas de extracção. Muita força com o fluxo de líquido causará células alimentadoras indesejados para sair também.
2. Recolher as células triturados num tubo cónico e centrifugar a 300 xg durante5 min. Nota: Um passo tripsinização pode ser adicionado com segurança aqui, se desejado pelo investigador.
3. Aspirar o sobrenadante e re-suspensão em meio fresco com células-tronco através de uma profunda pipetando para cima e para baixo para interromper colônias.
4. SSC placa em células alimentadoras recém-preparados inativadas com mitomicina-C, como descrito na seção 1.
5. Alimentar as células três vezes por semana, como se segue. Para a alimentação primeiro e segundo (por exemplo segunda-feira e Sexta-Feira) adicionar 50% em volume de meio fresco. Para uma alimentação terceiro (por exemplo, sexta-feira), aspirar todo o meio e substituir com 2 ml de meio fresco. Placas vai se tornar confluentes em 7-10 dias. As culturas devem ser constituídos por células germinativas> 98% (isto é, <1% de células somáticas contaminantes) após passagens 5-7, com base na coloração imunológica (por exemplo, utilizando o marcador de células germinativas murino GCNA) para distinguir as células germinativas de células somáticas ^10. Nota: Estes métodos foram desenvolvidos de acordo com as normas e exigências estabelecidas pela Instituiçãoal Animal Care e do Comitê Uso do Weill Cornell Medical College.

Resultados

A aparência do tipo passagem de zero selvagem, as colónias adultas SSC depois de 7 dias é mostrado na Figura 1. Tridimensionais colónias são constituídas por uma camada de células planas ligadas aos alimentadores ou matriz extracelular underling depositados pelos alimentadores com múltiplas camadas de SSC que crescem no topo. Enquanto SSC saudáveis ​​são brilhantemente refrangente e uniformemente 11-12 um de diâmetro, as bordas das células são difíceis de distinguir e o tamanho das colónias pode ser alt...

Discussão

Este método para derivar SSCs adultos utilizando células adultas derivadas de testículos de alimentação é robusto e tem êxito quando comuns origens genéticas (por exemplo, FVB, C57BL6 e 129SV/C57Bl/6 mista) e diferentes cepas mutantes foram empregados ^2,3,7,14. Na verdade, o microambiente criado pelo sistema de cultura é suficiente para superar algumas barreiras genéticas para manter SSC adultos in vivo (por exemplo, no caso de plzf ^{- / - de} animais) ^7. Enquant...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente / Material	Companhia	Número de catálogo	Comentários
DMEM	Corning	10-013	Diluente para a dissociação de tampão
Tripsina / EDTA	Mediatech	25-051 CI-
Caule meio base celular (StemPro-34)	Life Technologies	10639-011	Requer suplementação como por Shinohara et al. (2003) *
Stem suplementos médio de células	vário	ver a Tabela 3	Requer suplementação como por Shinohara et al. (2003) *
JK1 células	Célula Biolabs, Inc.	CBA-315	Pode substituir com adultos testiculares células do estroma como por Seandel et al. (2007)
mitomicina-C (CUIDADO)	Sigma-Aldrich	M4287	Tóxico; Manusear com cuidado.
Gelatina	Sigma-Aldrich	G1890	Solução a 0,4% em água
EVOS xl digitais microscópio invertido	Grupo de microscopia avançada	-
			Tabela 1. Reagentes e equipamentos específicos. * Ver Tabela 3
DMEM	Corning	10-013	Diluente para a dissociação de tampão
tripsina (1:250)	Life Technologies	27250-018	Tampão de dissociação: Final 0,05% p / v
colagenase tipo I, 235 U / ml	Worthington	CLS1 235	Dissociação buffer: 0,03% final p / v
DNAse I	Sigma-Aldrich	DN25	Dissociação tampão: Final 80 U / ml
albumina de soro bovino	ICP Bio	ABRE-100g	Tampão de dissociação: Final 0,5% em peso / vol
			Tabela 2. Dissociação tampão
StemPro-34 SFM	Life Technologies	10639-011
StemPro-34 Suplemento Nutriente	Life Technologies	10639-011
Suplementos adicionais **
Não-aminoácidos essenciais	Sigma-Aldrich	M7145	1X
MEM solução Vitamina	Life Technologies	11120-052	1X
L-glutamina	Mediatech	25-005	2 mM
albumina de soro bovino	ICP Bio	ABRE	0,50%
Antibiótico-antimicótico Solução	Mediatech	30-004 CI-	1X
D (+) glicose	Sigma-Aldrich	G8769	6 mg / ml
β-estradiol	Sigma-Aldrich	E2758	30 ng / ml
progesterona	Calbiochem	5341	60 ng / ml
de soro fetal bovino	variável	n / a	1%
holo-transferrina bovina	Sigma-Aldrich	T1283	100 ug / ml
insulina	Gémeos Bio-Products	700-112P	25 ug / ml
GDNF humano	Vida Techngias	PHC7041	10 ng / ml
bFGF humana	Life Technologies	PHG0023	10 ng / ml
rato EGF	Life Technologies	PHG0313	20 ng / ml
putrescina	Research Organics	0778P	60 uM
selenito de sódio	Sigma-Aldrich	S5261	30 nM
ácido pirúvico	Alfa Aesar	A13875	30 ug / ml
DL-ácido láctico	JT Baker	0196-04	1 ug / ml
β-mercaptoetanol	Life Technologies	21985-023	50 uM
ácido ascórbico	Sigma-Aldrich	A4544	100 uM
D-biotina	Sigma-Aldrich	B4639	10 | ig / ml
			Tabela 3. Stem meio celular
			* Nota: Adicionar suplementos antes de utilizar meio. Filtrar esterilizar e manter a 4 ° C. O meio é estável durante pelo menos 2 semanas.
			** Nós empregamos diferentes fabricantes, formulações e / ou números de lote de estes reagentes, sem quaisquer efeitos deletérios aparentes. Em geral, os reagentes de grau de cultura de células deve ser empregado.