Summary
Bloed-hersen barrière verstoring helpt de levering van bepaalde geneesmiddelen naar de hersenen. Mannitol geleverd intra-arterieel krimpt cellen rondom de bloedvaten om fysiek verstoren de barrière.
Abstract
Endotheelcellen met tight junctions met de basale membraan en astrocyt einde voeten heen hersenbloedvaten de bloed-hersenbarrière 1 te vormen. De barrière sluit selectief moleculen kruising tussen bloed en hersenen op basis van hun grootte en lading. Deze functie kan belemmeren de levering van geneesmiddelen voor neurologische aandoeningen. Een aantal chemotherapeutische geneesmiddelen, bijvoorbeeld niet doeltreffend de bloed-hersenbarrière te bereiken tumorcellen 2. Aldus verbeteren de afgifte van geneesmiddelen over de bloed-hersen barrière is een gebied van belang.
De meest voorkomende werkwijzen voor het verbeteren van de aflevering van geneesmiddelen aan de hersenen direct cerebrale infusie en bloed-hersenbarrière verstoring 3. Directe intracerebrale infusie garandeert dat therapieën de hersenen bereiken, maar deze werkwijze heeft een beperkt vermogen om het geneesmiddel te dispergeren 4. Bloed-hersen barrière verstoring (BBBD) aldieptepunten medicijnen om rechtstreeks voort uit de bloedsomloop in de hersenen en dus effectiever te bereiken gedispergeerd tumorcellen. Drie methoden van barrièrebeschadiging zijn osmotische barrièrebeschadiging, farmacologische barrièrebeschadiging, en focused ultrasound met microbellen. Osmotische verstoring, ontwikkeld door Neuwelt, gebruikt een hypertone oplossing van 25% mannitol dat de cellen van de bloed-hersenbarrière waardoor ze krimpen en verstoren de tight junctions ontwatert. Barrièrebeschadiging kan farmacologisch worden bereikt met vasoactieve stoffen zoals histamine en bradykinine 5 6. Deze methode is echter voornamelijk voor de selectieve hersentumoren afsluitorgaan 7. Bovendien werd RMP-7, een analoog van het peptide bradykinine, bevonden inferieur in vergelijking head-to-head met osmotische BBBD met 25% mannitol 8. Een andere methode, ultrasone (FUS) in combinatie met microbellen ultrageluid contrastmiddelen, is ook aangetoondom reversibel openen de bloed-hersen barrière 9. In vergelijking met FUS, hoewel, 25% mannitol heeft een langere geschiedenis van de veiligheid in menselijke patiënten dat maakt het een bewezen hulpmiddel voor translationeel onderzoek 10-12.
Om BBBD verwezenlijken moet mannitol worden geleverd met een hoge snelheid direct in de hersenen arteriële circulatie. Bij mensen wordt een endovasculaire katheter geleid naar de hersenen waar snelle, directe stroom kan worden bereikt. Dit protocol modellen menselijke BBBD zoveel mogelijk. Na een cut-down tot aan de splitsing van de gemeenschappelijke halsslagader, wordt een katheter ingebracht retrograde in de Rekenkamer en worden gebruikt om rechtstreeks te leveren mannitol in de interne halsslagader (ICA) circulatie. Propofol en N 2 O verdoving worden op hun vermogen om de effectiviteit van barrièrebeschadiging 13 maximaliseren. Indien correct uitgevoerd, deze procedure heeft de mogelijkheid om veilig, effectief en reversibel opent de bloed-hersenbarrière en improve de levering van geneesmiddelen die niet gewoonlijk de hersenen bereiken 8,13,14.
Protocol
1. Bereid Dier en Apparatuur voor Procedure
- Voordat chirurgie bereiden operatiegebied en het dier. Maak de halsslagader catheter door het invoegen van een 23-gauge naald in een stompe einde 12 "van PE50 buis. Snijd ongeveer 45 ° afschuining aan de andere kant van de katheter. Steriliseren materiaal voorafgaand aan de procedure. Dragen een haar motorkap, chirurgisch masker en steriele handschoenen.
- Plaats een verwarmingselement op het oppervlak waar de operatie wordt uitgevoerd. Activeer het en laat het opwarmen. Bedek het gebied met een absorberend bank kussen.
- Controleer of u 25% mannitol in oplossing hebben zonder kristallen. Als kristallen aanwezig, los ze Door de flacon in een heet waterbad bij 80 ° C en roeren periodiek.
- Noteer het gewicht van het dier.
- Een propofol verdunning voor bezorging bij 0,8 mg / kg / min met een snelheid van 0,1 ml / min.
- Plaats de rat in de inductie box gedurende 3 minuten. Instellingen: 5% isofluraan, 2 L / mindebiet op ventilator.
- Op de top van een wegwerp handdoek, scheren de nek en beide binnenkant van de dijen.
2. Intuberen de Rat
- Plaats het dier weer in de inductie box gedurende 3 minuten.
- Bereid uw endotracheale tube met een IV katheter. Voor dit formaat en de stam van de rat, gebruiken we een 18 ga katheter. De buis moet groot genoeg zijn om een goede luchtcirculatie mogelijk te maken, maar klein genoeg om te passen in de luchtpijp worden zonder schade te veroorzaken. Trek de naald uit de plastic catheter en zorgvuldig de naald breken ca. 1 cm van de scherpe punt. De stootte naald zal de stylus zijn. Steek de naald terug in de katheter.
- Hang de rat door de tanden op een schuin oppervlak.
- Direct een licht schijnen tegen de nek van het dier en een rij tussen de oren.
- Plaats een kleine spatel ca. 3 cm in de orofarynx. Til omhoog terwijl zachtjes trekken van de tong uit de mond.
- Visualiseer de opening van de luchtpijp. U zult seea klein gaatje dicht te openen en bij elke ademhaling.
- Steek katheter in het gat. U kunt soms het gevoel het plastic voer het kraakbeen van de luchtpijp. De luchtpijp is gevoelig. Forceer de katheter.
- Zet de ventilator op 1 L / min en 60 slagen per minuut en de isofluraan tot 2%.
- Sluit de katheter naar de ventilator en tape de buis het contactvlak.
- Controleer of het dier verdoofd door het uitvoeren van een teen knijpen.
3. Bepaal Propofol IV Anesthesie
- Zet de rat met tape alle vier de ledematen en de staart aan het bedrijfsresultaat oppervlak.
- Schrob de geschoren nek en lies sites met chloorhexidine zeep drie keer. Dan schrobben met chloorhexidine spoelen drie keer.
- Bevestig een injectiespuit met propofol aan een IV uitbreidingsset. Monteer de spuit op een infuuspomp.
- Met een scalpel, snijden door de huid van de geschoren dij. Vermijd het zagen spier.
- Open de incisie met krachtps aan de femorale ader te visualiseren.
- Trek weefsel over de slagader naar het schip bloot te leggen.
- Plaats een 26 ga Monoject veterinaire IV katheter in de ader. Wanneer de naald de wand van de ader lekke banden voel je het gemakkelijker worden om te duwen. Trek de naald en duw de katheter in het vat.
- Start de propofol infusie bij 0,1 ml / min.
- 3-5 min na aanvang van de infusie propofol, schakelt de anesthesie gas een mengsel van 50% O2 en 50% N2 O en zet de isofluraan.
4. Expose de splitsing van de gemeenschappelijke halsslagader
- Maak een incisie in de hals met scalpel.
- Snijd tussen de twee grote speekselklieren met een schaar of scalpel.
- Ontleden weg weefsel lateraal van de middellijn van de halsslagader bloot te leggen. Gebruik een tang om lagen van weefsel te openen. U kunt gebruik maken van een schaar om stukken die je bloot met de tang te verwijderen en om minimall bepaleny vasculaire. De controle bloeden met een gaasje, wattenstaafjes, en cauterisatie indien nodig.
- Injecteer 3 ml zoutoplossing IP als er sprake is van matige tot hevige bloedingen.
- Gebruik oprolmechanismen om weefsel weg te trekken van de halsslagader. Zoek de bifurcatie.
- Maak de occipitale slagader net distaal van de bifurcatie. Cauterize het tussen forceps en scheiden een elektrocauterisatie.
- Tang volledig bloot carotis bifurcatie en zoveel mogelijk de ECA.
- Expose de superieure schildklier slagader aftakking van de Rekenkamer distaal van de occipitale slagader. Cauterize het tussen forceps en scheiden een elektrocauterisatie.
5. Katheteriseren van de externe halsslagader
- Plaats 2 lengtes van 4/0 zijde onder de Europese Rekenkamer.
- Pak een lengte van hechtdraad met uw hemostat en schuif de Rekenkamer terug caudaal (naar de rat de voeten).
- Neem de andere hechtdraad en craniaal binden voor zover (in de richting van de rat mond) mogelijk wet een chirurg knoop. Dit vormt een permanente ligatuur om de Europese Rekenkamer te offeren.
- Verwijder de eerste hemostaat (degene die werd toepassen caudale spanning) en pak de andere hechtdraad (de een dat is geknoopt rond de Rekenkamer) en craniaal zachtjes spanning met de hemostaat.
- Losjes Bind een andere chirurg knoop (niet beveiligt - laat nauwelijks gebonden) distaal van de bifurcatie en proximaal van de permanente ligatuur.
- Spoelen met 1% lidocaïne om de slagader te ontspannen.
- Vul uw katheter met gehepariniseerde zoutoplossing.
- Plaats een tijdelijk voertuig clip zo dicht mogelijk bij de bifurcatie. Place vaartuig clip een hoek met ruimte voor katheterisatie maximaliseren. Schuif de losse knoop in de richting van de clip.
- Maak een kleine arteriotomie (snede) in ECA net proximaal van de ligatuur met microscissors. Er mag geen bloeding zijn als de clip en ligatuur zijn veilig.
- Behulp van een tang om de ECA wanden regelen, voer het afgeschuinde uiteinde van de katheter in het vat. Bevestig de katheter met de losse hechting knoop. Bind de slagader rond de katheter.
- Verwijder de clip en reinig het gebied met een wattenstaafje.
- De katheter tot ongeveer 1 mm distaal bifurcatie. Houd de slagader met forceps proximaal aan de knoop om een schip wordt geïmmobiliseerd.
6. Dien Mannitol
- Vul een 8 "IV verlengset en een 6 ml spuit met mannitol zonder dat eventuele luchtbelletjes Bewaar deze in de incubator bij 37 ° C. Opmerking: Snel met mannitol - Het zal gemakkelijk neerslaan uit de oplossing bij kamertemperatuur..
- Om te visualiseren BBBD, kunt u beheren Evans blauwe kleurstof en bekijk het in te voeren op het gebied van de hersenen waar de barrière is verstoord. Hiertoe geven het dier 2 ml / kg 2% Evans Blue door een nieuwe injectieplaats op de benen om de contralaterale propofol infusie.
- Bevestig de extensieset aan een 5 micrometer filteren en met mannitol te vullen om lucht bub verwijderenBles. Maak dan dit om de kraan zonder dat belletjes.
- Dien mannitol bij 0,09 ml / sec gedurende 25 sec. Letten de mannitol evenwicht te bereiken met de stroom in halsslagader een punt juist proximaal van de ICA. Het moet lijken te pulseren met het hart van de rat tarief. Als de mannitol gewoon naar beneden stroomt in de richting van het hart die je hebt overwonnen de rat bloeddruk. Dit kan leiden tot levensbedreigende complicaties en slechte BBBD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1. Visualiseren bloedhersenbarrière verstoring via Evans blauwe kleurstof extravasatie. Evans blauwe kleurstof is een pigment dat bindt aan albumine en is niet extravasatie in de hersenen onder fysiologische omstandigheden. Verstoring van de bloed-hersenbarrière aan een zijde van de hersenen kan Evans blauwe vlek te voeren en de verstoorde halfrond blauw terwijl de niet-verstoorde halfrond ongewijzigd. Dus is het een nuttige merker van bloed-hersenbarrière verstoring. Figuur 1A is een voorbeeld van een hersenen zonder bloed-hersenbarrière verstoring. Figuur 1B is een voorbeeld van een brain blauw gekleurd na osmotische BBBD met 25% mannitol. Merk op dat een halfrond is blauw gekleurd, terwijl de andere overblijfselen ongekleurd. Sommige blauw is binnengekomen linkerhelft nabij de mediale longitudinale spleet als gevolg van het mengen van de bloedstroom in thij Cirkel van Willis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn weinig middelen maximale werkzaamheid van BBBD. Het is belangrijk om bloeding minimaliseren tijdens het snijden van de installatie. Bloeddruk en hartslag kan worden beïnvloed door grote bloedingen en deze factoren is bekend dat de mate van BBBD 13 beïnvloeden. Bloeden kan worden verminderd door hechtingen grote bloedvaten, zoals de superieure schildklier en occipitale slagaders, die moeten worden gedeeld ligeren. Bovendien kan elektrocauterisatie worden gebruikt om schepen te verdelen en gebieden die een rijke bloedtoevoer hebben ontleden. Het is ook belangrijk om lucht en vaste stoffen van alle lijnen geplaatst in het dier - met name de halsslagader catheter. Snel werken met de mannitol helpt ervoor te zorgen dat de kristallen niet tot binnen de spuit of slang.
Het is belangrijk om een mannitol debiet dat effectief is voor de grootte en de spanning van rat die in dit experiment. De stroomsnelheid van de infusie mannitol moet overeenkomen met de druk in de gemeenschappelijke rat carotid slagader zodanig dat een hoge concentratie van mannitol uitmondt in de ICA zonder naar beneden stromen de gemeenschappelijke halsslagader in het hart en longen, die schade kan veroorzaken. Onderzoekers kiezen van een verschillende grootte en enkele rat dan gebruikt in deze studie moeten uitvoeren experimenten de juiste mannitol debiet vinden.
Een van de beperkingen van deze procedure is dat het offer van de ECA vereist. Zodra de katheter ECA is, wordt het moeilijk en onbetrouwbaar opnieuw katheteriseren. Zo kan deze procedure niet tweemaal uitgevoerd op hetzelfde halfrond. Bovendien moet verbindingen volgens het volgende BBBD zorgvuldig getest neurotoxiciteit. Sommige geneesmiddelen die gewoonlijk veilig gevaarlijk worden als ze eenmaal de bloed-hersenbarrière.
Ondanks deze beperkingen is BBBD op grote schaal gebruikt om de verstrekking van chemotherapie om hersentumoren 8,15-18 bestuderen. Het kan ook nuttig zijn voor andere therapeutische toepassingen in wELKE een geneesmiddel niet effectief de bloed-hersenbarrière en toedienen mannitol is bekend als veilig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de JB Marshall Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Long Evans rat | Harlan Laboratories | 210-250 g, male | |
| PE 50 Tubing | Beckton-Dickinson | ||
| 18 gauge x 2.5" IV catheter | Terumo | For ET tube | |
| 30" IV extension sets | Abbott | ||
| 26 gauge veterinary IV catheter | Monoject | ||
| Evans blue dye | Sigma | E2129 | |
| Bipolar | Codman | ||
| Filter, 5 μm | Braun |
References
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J.
- Smith, Q. R.
- Kroll, R. A., Neuwelt, E. A. Outwitting the blood-brain barrier for therapeutic purposes: osmotic opening and other means. Neurosurgery. 42, 1083 (1998).
- Kroll, R. A., Pagel, M. A., Muldoon, L. L., Roman-Goldstein, S., Neuwelt, E. A. Increasing volume of distribution to the brain with interstitial infusion: dose, rather than convection, might be the most important factor. Neurosurgery. 38, 746-754 (1996).
- Butt, A. M., Jones, H. C. Effect of histamine and antagonists on electrical resistance across the blood-brain barrier in rat brain-surface microvessels. Brain research. 569, 100-105 (1992).
- Inamura, T., Black, K. L. Bradykinin selectively opens blood-tumor barrier in experimental brain tumors. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 14, 862-870 (1994).
- Matsukado, K., et al. Enhanced tumor uptake of carboplatin and survival in glioma-bearing rats by intracarotid infusion of bradykinin analog, RMP-7. Neurosurgery. 39, 125 (1996).
- Kroll, R. A., et al. Improving drug delivery to intracerebral tumor and surrounding brain in a rodent model: a comparison of osmotic versus bradykinin modification of the blood-brain and/or blood-tumor barriers. Neurosurgery. 43, 879 (1998).
- Kinoshita, M., McDannold, N., Jolesz, F. A., Hynynen, K. Noninvasive localized delivery of Herceptin to the mouse brain by MRI-guided focused ultrasound-induced blood-brain barrier disruption. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103, 11719-11723 (2006).
- Neuwelt, E. A., Dahlborg, S. A. Chemotherapy administered in conjunction with osmotic blood-brain barrier modification in patients with brain metastases. Journal of neuro-oncology. 4, 195-207 (1987).
- Doolittle, N. D., et al. Safety and efficacy of a multicenter study using intraarterial chemotherapy in conjunction with osmotic opening of the blood-brain barrier for the treatment of patients with malignant brain tumors. Cancer. 88, 637-647 (2000).
- Guillaume, D. J., et al. Intra-arterial chemotherapy with osmotic blood-brain barrier disruption for aggressive oligodendroglial tumors: results of a phase I study. Neurosurgery. 66, 48 (2010).
- Remsen, L. G., et al. The influence of anesthetic choice, PaCO2, and other factors on osmotic blood-brain barrier disruption in rats with brain tumor xenografts. Anesthesia & Analgesia. 88, 559-559 (1999).
- Nilaver, G., et al. Delivery of herpesvirus and adenovirus to nude rat intracerebral tumors after osmotic blood-brain barrier disruption. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92, 9829 (1995).
- Fortin, D., McCormick, C. I., Remsen, L. G., Nixon, R., Neuwelt, E. A. Unexpected neurotoxicity of etoposide phosphate administered in combination with other chemotherapeutic agents after blood-brain barrier modification to enhance delivery, using propofol for general anesthesia, in a rat model. Neurosurgery. 47, 199 (2000).
- Neuwelt, E. A., et al. Primary CNS lymphoma treated with osmotic blood-brain barrier disruption: prolonged survival and preservation of cognitive function. Journal of clinical oncology. 9, 1580 (1991).
- Remsen, L. G., Trail, P. A., Hellström, I., Hellström, K. E., Neuwelt, E. A. Enhanced delivery improves the efficacy of a tumor-specific doxorubicin immunoconjugate in a human brain tumor xenograft model. Neurosurgery. 46, 704 (2000).
- Neuwelt, E. A., Pagel, M. A., Kraemer, D. F., Peterson, D. R., Muldoon, L. L. Bone marrow chemoprotection without compromise of chemotherapy efficacy in a rat brain tumor model. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 309, 594-599 (2004).
