Aplicação local de Drogas para estudar a função do receptor nicotínico de acetilcolina no cérebro do rato Fatias

Resumo

Neste trabalho, nós descrevemos um método útil para o estudo ligante fechado função de canal iônico em neurônios de fatias de cérebro de forma aguda isolados. Este método envolve a utilização de uma micropipeta cheia de medicamento para aplicação local de medicamentos para os neurónios gravados utilizando técnicas padrão de fixação de patch.

Resumo

O uso do tabaco leva a inúmeros problemas de saúde, incluindo câncer, doenças cardíacas, enfisema e infarto. Vício de fumar cigarro é uma doença prevalente neuropsiquiátrica que decorre das ações biofísicas e celulares da nicotina sobre os receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChRs) em todo o sistema nervoso central. Compreender os subtipos nAChR vários que existem em áreas do cérebro importantes para a dependência da nicotina é uma das prioridades.

Experimentos que empregam técnicas de eletrofisiologia, como célula inteira braçadeira patch ou dois eletrodos gravações braçadeira de tensão são úteis para a caracterização farmacológica de nAChRs de interesse. Células que expressam nAChRs, tais como as células do tecido de mamífero de cultura ou oócitos de Xenopus laevis, são fisicamente isoladas e são, portanto, facilmente estudado usando as ferramentas da farmacologia moderna. Muito progresso foi feito utilizando essas técnicas, particularmente quando o receptor alvo, já era conhecido umª expressão ectópica foi facilmente alcançado. Muitas vezes, no entanto, é necessário estudar nAChRs no seu ambiente nativo: em neurónios dentro fatias de cérebro de forma aguda colhidas a partir de ratos de laboratório ou ratos. Por exemplo, os ratos que expressa "hipersensíveis" subunidades nAChR tais como α4 ratinhos e ratos L9'A ^um α6 L9 é ^2, permitir uma identificação inequívoca dos neurónios com base na sua expressão funcional de uma subunidade de nAChR específico. Apesar de célula inteira gravações remendo da braçadeira de neurônios em fatias de cérebro é feito rotineiramente pelo eletrofisiologista hábil, é um desafio para aplicar localmente drogas como a nicotina ou acetilcolina para a célula gravado dentro de uma fatia do cérebro. A diluição de drogas para os superfusate (aplicação do banho) não é rapidamente reversível, e tubo em U de sistemas não são facilmente adaptados para funcionar com fatias de cérebro.

Neste artigo, descrevemos um método para rapidamente aplicar nAChR drogas ativadoras de neurônios registrados em adultos mOuse fatias de cérebro. Padrão de célula inteira gravações são feitas a partir de neurónios em fatias, e uma segunda micropipeta cheia com uma droga de interesse é manipulado para a posição perto da célula registada. Uma injecção de ar comprimido ou de azoto inerte para a pipeta cheia de medicamento provoca uma pequena quantidade de solução de fármaco a ser ejectada a partir da pipeta da célula registada. Usando este método, nAChR mediadas correntes podem ser resolvidos com a precisão de milissegundos. Tempos de aplicação de drogas pode ser facilmente variada, e a pipeta cheia de medicamento pode ser recolhido e substituído por uma nova pipeta, permitindo curvas concentração-resposta para ser criado por um único neurónio. Embora tenha sido descrita no contexto de nAChR neurobiologia, esta técnica deverá ser útil para o estudo de muitos tipos de canais iónicos dependentes do ligando ou de receptores nos neurónios de fatias de cérebro.

Protocolo

1. Preparação de Soluções de Preparação Cérebro Slice e Eletrofisiologia

1. As soluções para a preparação de fatias de cérebro foram previamente descritos ^{3, 4.} Preparar N-metil-D-glucamina (NMDG) baseada em corte e solução de recuperação com a seguinte composição (em mM): 93 N-metil D-glucamina, 2,5 KCl, 1,2 NaH ₂ PO _4, 30 _de NaHCO3, 20 mM de HEPES, 25 glucose, 5 de Na ⁺ ascorbato, 2-tioureia, 3 piruvato de Na ^+, 10 MgSO ₄ • 7H ₂ O, 0,5 CaCl ₂ 2H ₂ O. • Ajuste para 300-310 mOsm com NMDG. Ajustar o pH a 7,3-7,4 com 10 N de HCl.
   1. ....

Resultados

Em nossos experimentos, nós rotineiramente gravar a partir de dopamina (DA) de produção de neurônios da área tegmental ventral (VTA) e substantia nigra pars compacta (SNc). Em tensão-grampo modo, a aplicação de pressão ou de acetilcolina nicotina para essas células normalmente resultam em uma rápida corrente de catiões, para o interior, que atinge o pico dentro de 100-200 mseg (Figura 1A-B). Decaimento da corrente é em grande medida ditada por difusão da droga a partir do local de acção e, se enzimas na.......

Discussão

O método apresentado neste artigo é de grande utilidade para o estudo de ligante fechado função de canal iônico em preparações fatia do cérebro. No entanto, há uma série de factores que irão afectar significativamente a qualidade e reprodutibilidade dos dados experimentais, que resultam da utilização deste método. Por exemplo, as correntes evocadas são muito sensíveis ao diâmetro da ponta da pipeta e recheada de drogas. Pequenas dicas irá causar dificuldade com esvaziando a solução de drogas, e dicas de grande porte com.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente Empresa Número de catálogo
N-metil D-glucamina	Sigma	M2004
KCl	Sigma	P3911
NaH 2 PO 4	Sigma	S9638
NaHCO 3	Sigma	S6014
HEPES	Sigma	H3375
Glicose	Sigma	G5767
Na + Ascorbato	Sigma	A4034
Tiouréia	Sigma	T8656
Na + Piruvato	Sigma	P2256
MgSO 4 • 7H 2 O	Sigma	230391
CaCl 2 • 2H 2 0	Sigma	223506
NaCl	Sigma	S9625
Na + Pentobarbital	Vortech Pharmaceuticals	76351315
Gluconato de potássio	Sigma	G4500
EGTA	Sigma	E3889
Mg-ATP	Sigma	A9187
GTP	Sigma	G8877
DSK-Zero 1 vibratório slicer	Ted Pella, Inc.
P-97 Flaming / Brown micropipeta extrator	Sutter
Câmara RC-27 Gravação	Warner
TC-344B controlador de aquecedor Perfusão	Warner	640101
SH-27B aquecedor Solução	Warner	640102
Nikon FN-1	Nikon
C-7500 câmera de vídeo CCD	Hamamatsu
Picospritzer III	Geral Valve Co.
Micromanipulador MP-285	Sutter
PA-100 tradutor piezoelétrico	Piezosystem jena, Inc.
12V40 piezo amplificador	Piezosystem jena, Inc.
Axopatch 200B	Molecular Devices Corp
Digidata 1440A	Molecular Devices Corp