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Summary

Descreve-se um método de resolução super-imaging para sondar a organização estrutural da bacteriano FtsZ-ring, um aparelho essencial para a divisão celular. Este método baseia-se em análises quantitativas de microscopia fotoativados localização (PALM) imagens e pode ser aplicado a outras proteínas do citoesqueleto bacterianas.

Abstract

A divisão celular bacteriana requer a montagem coordenada de mais de dez proteínas essenciais para midcell ^1,2. Central neste processo é a formação de um anel supraestrutura-like (Z-ring) pela proteína FtsZ no plano de divisão ^3,4. O anel Z é constituída por múltiplas protofilamentos single-stranded FtsZ, e compreendendo o arranjo dos protofilamentos dentro do Z-ring irão fornecer indicações acerca do mecanismo de Z-anel de montagem e a sua função como um gerador de força de ^5,6. Esta informação permaneceu uma incógnita devido a limitações atuais em microscopia de fluorescência convencional e microscopia eletrônica. A microscopia de fluorescência convencional não é capaz de fornecer uma imagem de alta resolução do Z-ring devido ao limite de difracção de luz (~ 200 nm). Electron cryotomographic imagem detectou espalhados protofilamentos FtsZ em C. pequena células crescentus ^7, mas é difícil de aplicar a células maiores, tais comoE. coli ou B. subtilis. Aqui, descrevemos a aplicação de um método de microscopia de fluorescência de super-resolução, microscopia fotoativados localização (PALM), para caracterizar quantitativamente a organização estrutural do E. coli Z-ring ^8.

PALM oferece imagens de alta resolução espacial (~ 35 nm) e rotulagem específica para permitir a identificação inequívoca de proteínas-alvo. Nós FtsZ rotulados com a proteína mEos2 fotoactivável fluorescente, a qual muda de verde de fluorescência (excitação = 488 nm) para vermelho de fluorescência (excitação = 561 nm) após a activação a 405 nm ^9. Durante uma experiência de palma, individuais FtsZ-mEos2 moléculas são estocasticamente activado e as posições correspondentes do centróide das moléculas individuais são determinadas com <precisão nm 20. Uma imagem de super-resolução do anel Z é então reconstruído por sobrepondo as posições de todos os centróide detectados FtsZ-mEos2 moléculas.

<p class = "jove_content"> Usando este método, verificou-se que o Z-ring tem uma largura fixa de ~ 100 nm e é composto por um feixe de protofilamentos FtsZ solto que se sobrepõem uns aos outros, em três dimensões. Estes dados fornecem um trampolim para outras investigações das alterações do ciclo celular dependentes da ¹⁰ Z-anel e pode ser aplicado a outras proteínas de interesse.

Protocol

1. Preparação da Amostra Inocular meio LB com uma única colónia da estirpe JB281 [BW25113 / pJB042 (P Lac: FtsZ-mEos2)]. Crescer durante a noite num agitador a 37 ° C. Dilui-se a cultura de 1:1000 em meio mínimo M9 + [sais M9, 0,4% de glucose, 2 mM de MgSO4, 0,1 mM de CaCl 2, ácidos aminados e vitaminas MEM] e crescer a mid-log de ​​fase (OD 600 = 0,2-0,3) na presença de cloranfenicol (150 ug / ml) à temperatura ambiente (RT). Induzir a cultura com 20 mM de IPTG durante 2 horas (ver Nota 1). Pellet cultura em microcentrífuga (8000 rpm, 1 min) e ressuspender em um volume igual de M9 +; repetição. Após a re-suspensão em segundo lugar, o crescimento prosseguir à temperatura ambiente durante 2 hr. Fix cultura induzida com paraformaldeído a 4% em PBS (pH = 7,4) à temperatura ambiente durante 40 min. Pellet cultura e ressuspender em um volume igual de PBS; repetição. Se as células de imagem ao vivo, pular de fixação, a cultura da pelota, e ressuspender com volume igualde M9 – [sais M9, 0,4% de glucose, 2 mM de MgSO4, 0,1 mM de CaCl 2, ácidos aminados MEM]; reincidentes. Diluir 1:10 com contas de ouro cultura ressuspenso. Aplicar a amostra para a câmara de imagem preparado (ver passo 2.4). [1] Nota: O protocolo de indução acima (passos 1,1-1,3) foi optimizada para o sistema de expressão da estirpe JB281. Condições de indução de execução podem variar para outros sistemas de expressão ou de proteínas de interesse. 2. Assembleia da Câmara de imagem Fazer a 3% (w / v) de solução de agarose em M9 -. Melt agarose a 70 ° C num bloco de aquecimento de bancada durante 40 min. Loja agarose fundida a 50 ° C durante até 5 horas. Coloque um slide microaqueduct limpo na metade superior da câmara de imagem com os eléctrodos virados para baixo. Alinhar a junta inferior do slide microaqueduct de modo a cobrir os canais de perfusão. Aplicar ul ~ 50 da agarose fundida para o centro do vidroslide. Imediatamente superior a gota de gel de agarose com uma lamela limpa e seca. Permitir que o gel solidifique à temperatura ambiente durante 30 min. Para limpar lamelas: providenciar lamelas em um suporte cerâmico e sonicar durante 20 min em rotação banhos de acetona, etanol e KOH 1M em frascos de vidro. Repetir ciclo de três vezes, para um total de 9 sonicações, seguido por uma única sonicação em dH 2 O. Armazenar as lamelas limpas em fresco dH 2 O. Antes de usar, soprar lamelas secas com ar filtrado. Cuidadosamente remover a lamela, deixando almofada de gel no slide microaqueduct. Imediatamente adicionar 1 ml de amostra de cultura de células (ver passo 1.6) para a parte superior da almofada de gel. Espere por ~ 2 min, o que permite uma solução para ser absorvida pela almofada de gel. Almofada de gel superior com uma nova lamela, limpo e seco. Montar a câmara de imagiologia todo de acordo com as instruções do fabricante. 3. Aquisição de Imagem Ligue o microscópio, câmera e lasers. Abra MetaMorph suaveWare (Molecular Devices). Coloque apropriadas de excitação / emissão de filtros no caminho de imagem (Figura 1). Definir poderes laser e configurações de aquisição em conformidade. 488-nm = 15 mW de laser (ver Nota # 2) 561-nm do laser = 75 mW 405-nm do laser = 2 mW ± filtro de densidade neutra (Nota n º 3) Bloquear câmara de imagens na fase através do adaptador etapa complementar. Designa uma região de imagem apropriado (100×100 pixels), que é homogeneamente iluminado por todas as três lasers. Identificar uma área de amostra que contém ambas as células e marcadores fiduciais (esferas de ouro) em estreita proximidade, mas não se sobrepõem. Concentre-se na superfície de células mais próximas da lamela. Adquirir uma imagem de campo claro com 50 ms de tempo de integração e mover o foco 0,5 m na amostra (Figura 3Ai). Adquirir imagem conjunto verde fluorescência com excitação a partir do 488-n m laser utilizando um tempo de integração 50 ms (Figura 3Aii). Adquirir streaming de vídeo no canal vermelho com iluminação contínua de 405 nm e 561 nm lasers. Para as células fixas, uma 50 taxa de quadros ms é utilizado para um total de 20.000 frames (total de ~ 17 min), com a potência do laser 405 nm, em rampa de ~ 10% por cada 1000 quadros (ver nota 4). Para as células vivas, a taxa de quadros 10 ms é usado para um total de 3.000 quadros (~ 30 s total) com uma potência de laser de 405 nm, constante. Mover o foco de volta para a superfície inferior das células e adquirir outra imagem de campo claro como no passo 3.7. [2] Nota: A intensidade integrada da fluorescência verde de uma célula é directamente proporcional ao número total de FtsZ-mEos2 moléculas expressas na célula. A potência de excitação de 488 nm e configurações de conjuntos de fluorescência de aquisição deve ser mantido constante para todas as células de modo que a relação FtsZ-mEos2 níveis de expressão em diferentes células pode ser comparado. ONTEÚDO "> [3] Nota:. células fixas são gravadas com a densidade neutra (ND) filtro (Figura 1, o componente óptico # 5) no local, a fim de atingir uma taxa de activação lenta, de modo que cada molécula individual pode ser identificado com precisão A ND filtro é removido quando as células de imagens ao vivo para aumentar a taxa de activação, enquanto se mantém baixa a probabilidade de duas moléculas de ser activadas em simultâneo numa zona de difracção limitada. A taxa mais rápida aplicada ao vivo de células de imagem é necessária para diminuir o tempo de aquisição total, assim "congelar" o anel Z-in-time e limitar o efeito do fotodano para a célula. [4] Nota: Os números de quadros adquiridos foram optimizados para o nosso sistema e são dependentes da estrutura celular particular, a rotulagem, densidade e taxa de activação se esgotar a totalidade do conjunto das fluoróforos é importante para a análise. Em células vivas, é importante para se obter um número suficiente de localizações no mais curto período de um time quanto possível para evitar a desfocagem da imagem devido ao movimento da estrutura celular. 4. PALM Construção da Imagem Determinar a posição do centro de gravidade de cada mancha detectada. Carregue a pilha de imagem em Matlab (MathWorks, Inc). Corte a pilha de imagens de uma região em torno de uma célula que exclui todas as contas fiduciais. Seleccionar um limiar de intensidade para a detecção de ponto que está acima do nível de fundo, mas abaixo do ponto de intensidade média. Nós contabilizar a variação no nível de fundo ao longo de uma experiência através do cálculo da média de funcionamento de intensidade máxima usando uma janela de quadro 150. O limiar de intensidade para cada quadro é então interpolada a partir dos valores médios de execução. Subtrair o limiar correspondente a partir de cada quadro. Pontos potenciais são identificados como três pixels adjacentes com intensidades acima do limiar. Ajustar a intensidade de fluorescência de cada mancha para um potencial Gaussia bidimensionalfunção n [Equação # 1], utilizando um algoritmo não linear, pelo menos um quadrado (Figura 2). A precisão a localização de cada ponto é calculado o número total de fotões detectados [Equação # 2]. Qualquer mancha mal-fit com uma precisão de localização superior a 20 nm (células fixas) ou 45 nm (células vivas) é descartado (ver nota 5). Qualquer lugar com uma intensidade maior do que duas vezes maior de intensidade média, possivelmente devido à sobreposição de emissores, também é descartada. Para as células fixas, retire observações repetidas da mesma molécula, desconsiderando qualquer local cujo centróide posição é no prazo de 45 nm de qualquer outro lugar que o precedeu por 6 quadros ou menos. Para as células vivas, todos os pontos são retidos. Calibrar deriva amostra usando movimento marcador fiducial. Colheita fora de uma região de pixel 10×10 em torno de um marcador fiducial. Subtrair o limiar respectivo determinado em 4.1.3 a partir de cada quadro. Encaixe o perfil de intensidade em cadaarmação através de mínimos quadrados algoritmo apropriado assumindo uma forma Gaussiana bidimensional. Calcule o deslocamento entre as posições centróide em relação ao quadro 1. Corrigir a posição do centróide de cada molécula única identificada em 4.1 com a deriva amostra adequada calculado em 4,2. Comparar as imagens de campo claro adquiridos em 3.7 e 3.10. Se as células são observadas a mover-se relativamente aos marcadores fiduciais, os dados são lançados para fora. Sobrepor todas as posições corrigidas centróide em uma única imagem composta de pixels 15×15 nm. Traçar cada molécula única, como uma unidade de área, perfil gaussiano bidimensional centrada na posição centróide com um desvio padrão igual a precisão de localização [Equação # 2]. Isso resulta em um mapa de densidade de probabilidade, em que a intensidade de um pixel é proporcional à probabilidade de encontrar uma molécula em que o pixel (Figura 3Aiv). Comparando imagens de palma para imagens do conjunto. Replot o centroposições id como em 4.4, mas em um avião com 150×150 pixels nm e um desvio padrão igual a 250 nm. Isto gera uma imagem PALM que imita uma imagem de difracção limitada, que pode ser usado para comparar com a imagem de conjunto de difracção limitada, adquirida em 3,8 (Figura 3Aiii). Para confirmar que as moléculas detectadas são representativos de toda a população, comparar a imagem reconstruída conjunto (Figura 3Aiii, passo 4.5.1) com o conjunto experimental imagem de fluorescência (Figura 3Aii, passo 3.8) para confirmar que as duas imagens mostram estruturas de forma semelhante , orientação e intensidade relativa. [5] Nota: A precisão de localização mínimo requerido foi determinado empiricamente para cada método de imagem, marcando as precisões de todas as moléculas de uma dada amostra e seleccionando um corte apropriado. 5. PALM Análise de Imagem Medindo Z-Ring Width e diâmetro. Rodar a imagem, de modo a PALM verticalmente orientar o eixo do comprimento da célula (Figura 4A). Recorte da região celular contendo o Z-ring. Calcular a intensidade cumulativo, projetando um perfil de intensidade ao longo do eixo longo da célula. Encaixe o perfil de intensidade a uma distribuição de Gauss. A largura do anel é definido como o máximo de largura total a metade (FWHM) da distribuição de Gauss ajustada (Figura 4B). Projetar o perfil de intensidade acumulada de 5.1.2 ao longo do eixo curto da célula. O diâmetro do anel é definido como o comprimento do perfil de intensidade (Figura 4C). Plotagem Densidade FtsZ (ver Nota 6). Replot as posições centróide como em (4.4), mas sem o perfil gaussiano de tal modo que cada molécula original é dado um valor de 1 e atribuído a um único pixel correspondente à sua posição centróide. Deste modo, a intensidade de cadapixel representa o número total de moléculas detectadas naquele pixel. A imagem PALM densidade também pode ser visualizado como um gráfico de contorno (Figura 5E). Determinar a resolução espacial. Teoricamente possível resolução espacial: criar um PSF representante para toda a amostra usando a precisão de localização média determinada de todas as moléculas detectadas e calcular o FWHM (Equação 3). Experimentalmente obtida resolução espacial: calcular a média de deslocamento entre as observações repetidas da mesma molécula. [6] Nota: Utilizou PALM de reflexão interna total (TIR-PALM, Figura 1 e 5) para restringir a activação e estimulação de uma camada fina (~ 200 nm) acima da interface celular / vidro. de modo que as moléculas apenas FtsZ associados com a membrana mais próximo da lamela irá ser detectado.

Representative Results

Ilustrado na Figura 3Aiv é um bi-dimensional, render super-resolução do anel Z-gerado a partir do método de imagem PALM descrito acima. Abaixo, resumem-se informação qualitativa e quantitativa que pode ser obtido a partir deles. Qualitativamente, observamos que o Z-anel é uma estrutura irregular que adota várias configurações (única banda ou arco helicoidal) que não são distinguíveis em imagens convencionais de fluorescência (Figura 3A comparar-Dii</st…

Discussion

Imagens PALM contêm informações sobre as contagens de moléculas e posições dentro de uma célula, permitindo uma análise detalhada da distribuição e arranjo de moléculas de proteína alvo que é difícil de conseguir por outros meios. Abaixo destacamos as precauções que devem ser tomadas para extrair informações quantitativas precisas, mantendo a relevância biológica de imagens de palma. Nós também explorar a informação que pode ser melhor obtidos utilizando células vivas vs fixo. Por fim, sugerimos…

Materials

50 x MEM Amino Acids	Sigma	M5550
100 x MEM Vitamins	Sigma	M6895
IPTG	Mediatech	46-102-RF
16% Paraformaldehyde	Electron Micrsocopy Sciences	15710-S
SeaPlaque GTG Agarose	Lonzo	50111
50 nm Gold Beads	Microspheres-Nanospheres	790113-010
FCS2 Imaging Chamber	Bioptechs
Stage Adaptor	ASI	I-3017
Inverted Microscope	Olympus	IX71
1.45 NA, 60x Objective	Olympus
IXON EMCCD Camera	Andor Technology	DU897E
488-nm Sapphire Laser	Coherent
561-nm Sapphire Laser	Coherent
405-nm CUBE Laser	Coherent