Quantificar glomerular Permeabilidade de Macromoléculas fluorescentes Usando Microscopia 2-Photon em Munique Ratos Wistar

Summary

Uma técnica de alta resolução utilizando microscopia intavital 2-fotão para visualizar e quantificar directamente filtração gloemrular nos glomérulos superfície. Este método permite a determinação direta de características de permeabilidade de macromoléculas em estados normais e doentes.

Abstract

Doenças renais envolvendo perda urinária de grandes macromoléculas essenciais, tais como albumina do soro, têm sido desde há muito se pensa ser causada por alterações na permeabilidade da barreira composta de podócitos, as células endoteliais vasculares, e uma membrana basal trabalhando em uníssono. Dados do nosso laboratório usando microscopia intravital dois fótons revelou uma barreira mais permeável de filtração glomerular (GFB) do que se pensava em condições fisiológicas, com a recuperação de albumina filtrada ocorrendo em um subconjunto inicial de células chamadas células do túbulo proximal (PTC) ^{1,2 3.}

As técnicas anteriores usados ​​para estudar a filtração renal e estabelecer a característica da barreira de filtração envolvido micropunção do lúmen desses segmentos tubulares de amostragem mais cedo com o conteúdo ea análise do fluido ^4. Estes estudos determinaram a concentração de albumina no fluido luminal ser virtualmente inexistente; correspondente estreitamentecom o que é normalmente detectado na urina. No entanto, a caracterização de polímeros de dextrano com tamanhos definidos por esta técnica revelou aqueles com uma dimensão semelhante à albumina do soro tinham níveis mais elevados no lúmen tubular e de urina, o que sugere uma maior permeabilidade ^5.

Aqui é uma descrição pormenorizada da técnica utilizada para visualizar diretamente e quantificar glomerular fluorescente permeabilidade albumina in vivo. Este método permite a detecção da albumina filtrada através da barreira de filtração para o espaço de Bowman (a câmara de filtração inicial urinária) e também permite a quantificação de albumina reabsorção pelo túbulo proximal e visualização subsequente de transcitose albumina ^6. A ausência de albumina fluorescente ao longo dos segmentos tubulares posteriores rota para a bexiga realça a eficácia da via de recuperação nos segmentos tubulares proximais anterior. Além disso, quando esta técnica foi aplicada para determinar a permeabilidadedos foram relatados dextranos possuindo um tamanho semelhante aos valores de permeabilidade virtualmente idênticos albumina ^2. Estas observações suportam diretamente a necessidade de ampliar o foco de muitas doenças renais proteinúricas para incluídos alterações na recuperação de células do túbulo proximal.

Protocol

1. Conjugação de albumina de soro de rato Sulfo-rodamina 101 sulfonilo (vermelho do Texas)

1. Dissolve-se 100 mg de albumina de soro de rato (RSA) em 6.667 ml de bicarbonato de sódio a 100 mM pH 9,0; concentração final de 15 mg / ml num tubo de 50 mL cónico.
2. Solução lugar no gelo / água copo e legal entre 0 e 4 ° C.
3. Adicionar 200 mL de dimetil formamida anidra qualidade elevada (DMF) a um frasco de 10 mg de cloreto de sulfonilo vermelho do Texas (TRSC); vórtice no meio durante 15 seg.
4. Solução RSA Vortex no meio e adicione o TRSC dissolvido.
5. Envoltório cónico de 50 ml em folha (Parafilm pode ser usado para assegurar uma ....

Results

A Figura 3 mostra um exemplo de uma imagem feita a partir de uma superfície de um glomérulo Munique Frömter rato Wistar e as medidas tomadas para determinar a permeabilidade da albumina fluorescente. O valor do SGC para a albumina derivada de 0,0111 para esta queda glomérulo individual no intervalo visto nesta linhagem de ratos Wistar de Munique, quando na condição alimentada ^3. A estabilidade visto nestas imagens é devido à concepção e execução de instruções representadas nas Figuras.......

Discussion

Os passos destacados aqui representam o que sentimos ser aqueles que irão produzir valores de permeabilidade consistentes e precisas, porque eles contornar as seguintes armadilhas:

1. Dispersão: a utilização de um emissor de fluoróforos vermelhos permitem uma recolha mais eficiente da luz uma vez que mais fotões de comprimento de onda são menos propensas a dispersão. Usando tanto fluorophores emissores verdes ou azuis irá introduzir uma maior variação na GSC da causa do aumento da variabilidade nos valores de .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscópio confocal/multi-fotônico Olympus Floview 1000	Olympus America		Filtros para detectores: Azul 430/100, Verde 525/50, Vermelho 605/90
Mode-Locked Ti:Sapphire Mai Tai Laser	Spectra-Physics		Comprimentos de onda de excitação sintonizáveis: ~750-1150 nm
Fotodetectores de fosfeto de arseneto de gálio	Hamamatsu Corp		Nota: Configurações montadas na frente ou na lateral disponíveis.
Software de processamento de imagem Metamorph	Molecular		Dynamics Nota: Versão 6.1r1
Microsoft Excel	Microsoft Corportation		versão 2007
Manuseio de fórceps	Microscopia eletrônica Ciências	Cat# 78266-04
Mayo Tesoura de dissecação	Microscopia eletrônica Ciências	Cat# 72962
CA Micro tesoura Modelo 1C300	Ciências de Microscopia Eletrônica	Cat# 78180-1C3
Kelly Fórceps Hemostático (reto)	Ciências de Microscopia Eletrônica	Cat# 72930
Manta de Camisa de Água + Almofada de Aquecimento	Gaymar		T/Bomba PN 11184-000 Manta-66N111CC
Repti-Therm Sob o Aquecedor do Tanque	ZooMed		RH-4
Texas Red Sulfonyl Chloride	Invitrogen/Molecular Probes	Cat# T-353
Soro de Rato Albumina	Sigma Aldrich	Cat# A-6272
DMF Anidro de Alta Qualidade	Sigma Aldrich	Cat# 270547
Strate-Line Autoclave Tape	Fisher Scientific	Cat# 11-889-1
Pratos de Fundo de Lamínula Willco-dish (50 mm/40 mm)	Microscopia Eletrônica Ciências	Cat# 70665-07