Summary
Una tecnica per manipolare geneticamente le cellule epiteliali in tutta
Abstract
Branching morfogenesi avviene durante lo sviluppo di molti organi, e l'embrione ghiandola sottomandibolare mouse (SMG) è un modello classico per lo studio di branching morfogenesi. Nel SMG sviluppo, questo processo comporta fasi iterative di gemma epiteliale e formazione condotto, per dare infine origine a una complessa rete ramificata di acini e condotti, che servono per produrre e modificare / trasportare la saliva, rispettivamente, nella cavità orale 1 - 3. Il epiteliale associata membrana basale e aspetti del compartimento mesenchimale, comprese le cellule mesenchimali, fattori di crescita e la matrice extracellulare, prodotti da queste cellule, sono fondamentali per il meccanismo di ramificazione, anche se come gli eventi cellulari e molecolari sono coordinate rimane poco compresa 4 . Lo studio dei meccanismi molecolari di guida anticipi morfogenesi epiteliali la nostra comprensione dei meccanismi di sviluppo e permette di comprendere meglio possibile rigeapprocci di medicina ative. Tali studi sono stati ostacolati a causa della mancanza di metodi efficaci per la manipolazione genetica dell'epitelio salivare. Attualmente, trasduzione adenovirale rappresenta il metodo più efficace per il targeting cellule epiteliali in ghiandole adulti in vivo 5. Tuttavia, in espianti embrionali, mesenchima denso e la membrana basale che circonda le cellule epiteliali ostacolo all'accesso virale alle cellule epiteliali. Se il mesenchima viene rimosso, l'epitelio possono essere trasfettate con adenovirus, e può riprendere rudimenti epiteliali branching morfogenesi in presenza di Matrigel o laminina-111 6,7. Mesenchima-free crescita epiteliale rudimento richiede anche una ulteriore integrazione con fattori di crescita solubili e non pienamente ricapitolare morfogenesi ramificazione come si verifica in ghiandole intatti 8. Qui si descrive una tecnica che facilita adenovirale trasduzione delle cellule epiteliali e la cultura del e transfettatepithelium con mesenchima associati. Dopo microdissezione dei fucili mitragliatori embrionali, la rimozione del mesenchima, e l'infezione virale dell'epitelio con una GFP contenente adenovirus, si dimostra che l'epitelio ricombina spontaneamente con mesenchima non infetti, ricapitolando intatta la struttura ghiandolare SMG e la ramificazione morfogenesi. La popolazione geneticamente modificato delle cellule epiteliali possono essere facilmente monitorato con metodi standard di microscopia a fluorescenza, fluorescenza se-tagged costrutti adenovirali sono utilizzati. Il metodo di ricombinazione tessuto descritto è attualmente il metodo più efficace ed accessibile per la trasfezione di cellule epiteliali con un vettore wild-type o mutanti all'interno di un costrutto complesso tessuto 3D che non richiede la generazione di animali transgenici.
Protocol
Il protocollo prevede quattro fasi principali, come illustrato nella Figura 1. Tutti i passaggi sono descritti in dettaglio. Costruzione adenovirus e purificazione virale deve essere fatto prima della raccolta di organi per l'uso nella trasduzione genetica di sezionati rudimenti epiteliali. Tutti gli standard di BSL-2 misure di sicurezza devono essere seguite quando si lavora con adenovirus.
1. Embrionali di topo sottomandibolare Gland (SMG) Raccolta e Microdissection
- Eutanasia topi di sesso femminile a tempo-in stato di gravidanza (ceppo consanguinei CD-1 o ICR) con emissioni di CO 2 narcosi, seguita da dislocazione cervicale e archi raccolta di embrioni di topo al giorno embrionale 13 (E13, 3-5 gemme epiteliali) seguenti procedure approvate dal IACUC istituzionale comitato. Il giorno della scoperta tappo vaginale è designato come E0. Ghiandole salivari possono essere raccolte e coltivate nella fase E12 quando vi è un singolo germoglio primario e gambo con fessure iniziandoper iniziare. SMGs prima di questa fase, richiedono condizioni di coltura diverse da quelle indicate.
- Trasferire stringhe embrioni in sterili 10 piatti tessuto centimetri coltura riempite con 25 ml di DMEM / Ham 's Medio F12 (F12) manca rosso fenolo (Life Technologies), integrato con 100 U / ml di penicillina, e 100 pg / ml di streptomicina (pen-strep, Life Technologies).
- Usando un bisturi sterile (# 11 pale) e pinza (# 5, Strumenti scientifici Arti, 11252-20), rimuovere gli embrioni dalle sacche in una separata 10 portata cm contenente 25 ml di DMEM/F12 + pen-streptococco.
- Sever le teste di embrioni con un taglio angolato appena sotto la mascella inferiore.
- Isolare le mandibole inferiori dalle teste sotto un microscopio da dissezione stereo con una base di luce trasmessa (Nikon SMZ645 o equivalente) con un taglio sotto la mascella superiore. Posizionare i tessuti sopra un ulteriore pezzo di vetro piuttosto che direttamente sul componente in vetro della base del microscopio.
- Raccogliere le mandibole inferiori in 3 ml di DMEM/F12 + pen-strep in una piastra da 35 sterile cultura del tessuto mm.
- Una fetta mandibola sulla scena microscopio da dissezione modo che la linguetta è sul fondo della fetta, ma è rivolta verso la posizione 12:00.
- Utilizzando un lato due pinze incrociate in un movimento a forbice, rimuovere ed eliminare il rd 1/3 inferiore della fetta mandibola.
- Ruotare di 90 ° sezione a destra (se la mano destra) e, con un taglio a forbice con le pinze, tagliare la parte superiore della fetta mandibola (senza il taglio della lingua) a metà strada nella fetta.
- Sbucciare il tessuto in eccesso e rimuoverlo per esporre i fucili mitragliatori sotto. Ci sarà uno su ciascun lato vicino alla base della lingua.
- Usando un paio di pinze a tenere premuto il tessuto con la lingua, usare il forcipe altri a prendere in giro la SMG di distanza dalla lingua. Ripetere l'operazione per la ghiandola altro.
- Raccogliere le ghiandole salivari microdissezione in 3 ml di DMEM/F12 + pen-strep in un nuovo tessuto sterile 35 millimetricultura piatto. Nota: le ghiandole sottomandibolari più grandi (3-5 gemme epiteliali) insieme al più piccolo collegato ghiandola sublinguale (1 auricolari) possono essere coltivate intatto saltando al punto 4 ed eseguito le fasi 4.1, 4.3, e 4.4, come descritto in precedenza 2,8.
2. SMG separazione epiteliale Rudiment
- Posto 5 (o più) ghiandole salivari in un fondo di vetro, diametro 50 mm micropozzetti piatto (MatTek Corporation, P50G-1.5-14-F) contenente 200 ml di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS privo di Ca + + e Mg + +, Life Technologies) contenente 0,4% (v / v) dispasi (Life Technologies, cat. no. 17.105-041) e incubare per 15 min a 37 ° C.
- Dopo l'incubazione, utilizzando una sterile 200 microlitri punta della pipetta, aspirare accuratamente la soluzione dispasi senza disturbare le ghiandole. Immediatamente aggiungere 200 microlitri di DMEM/F12 supporto contenente 5% (w / v) BSA (DMEM/F12-BSA, pre-sterilizzati con un filtro di 0,22 micron) per neutralizzare l'dispasi. <li> Sotto un microscopio da dissezione, usando un paio di pinze con le punte fini (# 5 Dumostar, Strumenti scientifici Arti, 11295-20), separare delicatamente il mesenchima allentato intorno ai germogli SMG epiteliali e condotti, avendo cura di lasciare l'epitelio intatto .
- Pre-wet una sterile 200 ml con puntale DMEM/F12-BSA media e pipettare delicatamente i rudimenti epiteliali in un nuovo piatto di 50 mm di diametro pozzetto contenente 200 ml di DMEM/F12 + pen-streptococco. Utilizzare una punta di alta qualità 200 microlitri pipetta con un bordo liscio.
- Nel piatto che contiene i pezzi mesenchima, scartare qualsiasi non-tessuto mesenchimale comprese le ghiandole sublinguali e le gemme staccate ghiandola sottomandibolare.
3. L'infezione adenovirale di Rudimenti epiteliali
- Marca 200 pl di supporti infezione virale diluendo l'adenovirus di interesse in DMEM/F12 + pen-strep in una provetta da microcentrifuga modo che il titolo della soluzione risultante è 1x10 8 -10 9 PFUs. Iltitolo ottimale necessaria per diversi virus possono variare. È importante usare cloruro di cesio (CsCl)-preparazioni purificate virali per efficienza assorbimento ottimale.
- Rimuovere il supporto dal piatto contenente i cinque rudimenti epiteliali. Rapidamente aggiungere 200 microlitri di media infezione, mantenendo i rudimenti sempre umida. Prendere le necessarie precauzioni nel maneggiare il virus e lo smaltimento dei puntali contaminati. Disinfettare eventuali virus superfici contaminate con soluzione di candeggina al 10%.
- Spostare i rudimenti epiteliali lontani l'uno dall'altro con una pinza per evitare che si attacchino e consentire loro di depositarsi sul fondo della piastra. Incubare rudimenti in media virali per 1 ora a temperatura ambiente. Durante l'incubazione, separare i rudimenti, se si muovono vicini. Dondolo eccessivo o movimento permetterà le ghiandole ad ammassarsi.
- Dopo l'incubazione, rimuovere delicatamente le virali contenenti i media ed eliminare in modo appropriato, facendo attenzione a non disturbare il rudiments. Aggiungere 200 ml di DMEM/F12 + pen-streptococco. Ripetere il lavaggio almeno altre due volte e sostituirlo con 200 ml di DMEM/F12 + pen-strep media. I lavaggi sono fondamentali per rimuovere eventuali virus che non è fortemente collegato al epitelio e per prevenire l'infezione del mesenchima.
- Incubare rudimenti epiteliali con 200 ml di DMEM/F12 contenente 2% (v / v) Matrigel (BD Biosciences, 356.231) per 20 min. Troviamo che questo breve incubazione in Matrigel minimizza la regressione di fessure esistenti durante il periodo di coltura iniziale, ma questo passaggio può essere omesso se l'esposizione a Matrigel non è desiderato.
4. Ex vivo di cultura fucili mitragliatori ricombinato
- Posizionare ogni rudimento, uno alla volta, utilizzando un pre-wet 200 microlitri punta della pipetta, sopra un intaglio (piccolo taglio) 13 mm, 0,1 um Nuclepore Track-Etch membrana filtro (Whatman) galleggianti su 200 microlitri di terreni di coltura ( 5 rudimenti / filtro) in un fondo di vetro per micropiastre. La cultura dei mediaè: DMEM/F12 + pen-strep contenente 50 ug / ml di transferrina e 150 ug / ml di acido ascorbico, come precedentemente descritto 2,8. La transferrina è noto per stimolare la sopravvivenza e la ramificazione morfogenesi delle ghiandole salivari e espianti di organi di altri 9. Aggiunta di acido ascorbico è stato mostrato per stimolare SMG ramificazione. 10 E 'noto per agire come cofattore in molte reazioni di idrossilazione di vie metaboliche (come idrossilazione prolina durante la formazione di fibre collagene 11) e stimola anche la produzione di fibronectina e laminina in espianti altri organi 12.
- Rimuovere come media molto sulla parte superiore del filtro possibile dopo l'aggiunta di ogni rudimento epiteliale. Quantità eccessiva di supporti sulla parte superiore del filtro può causare il filtro di affondare, mentre meno dei media, rende il posizionamento dei rudimenti e mesenchima molto più facile. Supporti in eccesso può essere rimosso o con una pipetta o utilizzando pinze per afferrare il materiale tra le punte.
- Luogo pezzi mesenchima derivato from 3-4 ghiandole sulla parte superiore e / o intorno ad ogni rudimento epiteliale. Rimuovere eventuali supporti aggiuntivi che circonda le ghiandole per evitare movimenti del mesenchima lontano dai rudimenti. Mesenchima deriva dal più ghiandole non è utile ma meno può essere dannoso per la crescita epiteliale rudimento.
- Incubare SMGs ricombinati in un incubatore umidificato (95% aria / 5% CO 2) a 37 ° C per 48 -72 ore, come desiderato.
- Acquisire campo chiaro e / o immagini fluorescenti di ghiandole in scena a 0 ore (se lo si desidera), 2 ore dopo la ricombinazione e ogni 24 ore in seguito con microscopio ottico invertito, in posizione verticale, o stereo dotato di una fotocamera digitale con un obiettivo di ingrandimento 4X o 5X per catturare l'intera ghiandola ricombinato in un singolo fotogramma di vista. Immagini della ghiandola salivare mostrano il miglior contrasto utilizzando l'impostazione campo chiaro o l'anello di fase eventualmente montata un certo punto del percorso della luce (che non è possibile a completamente automatizzati microscopi). Contrasto di fase standard non èt necessario poiché la ghiandola è spesso e crea contrasto.
- I desiderati punti temporali, SMGs ricombinati possono essere fissate per 20 minuti con soluzione fissativa realizzati 2% paraformaldeide (PFA) in 1X PBS contenente 5% (w / v) di saccarosio (per preservare meglio la struttura cellulare interna, mantenendo le cellule in uno stato isosmotic). Diversamente 4% PFA, 2% PFA manterrà una quantità significativa del segnale GFP se il fissativo è completamente rimosso dopo fissazione. Le ghiandole possono essere conservati per un massimo di 1 settimana in 1X PBS al buio a 4 ° C fino intera immunocitochimica montaggio e di imaging confocale viene eseguita, come riportato precedentemente 3,6,13-15. Idealmente, immunocitochimica e di imaging deve essere eseguita subito dopo la fissazione per ottenere le migliori immagini. Ghiandole possono anche essere lisate in tampone RIPA per SDS-PAGE seguita da Western blotting.
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Representative Results
Il flusso delle fasi principali sperimentali è descritto nella Figura 1. Un esempio di un SMG intatto, un rudimento isolato epiteliale, e il mesenchima corrispondenti sono mostrati nella Figura 2. Immagini brightfield di SMGs ricombinati, che continuano a subire branching morfogenesi quando coltivate ex vivo per i tempi riportati, sono mostrati in Figura 3. Ghiandole ricombinati coltivate per 48 ore esprimere GFP epiteliale sono mostrati in Figura 4. Immagini confocali di SMGs ricombinati fisso e ripreso dopo 72 ore in coltura seguita mediante immunocitochimica, sono mostrati in Figura 5. Il marcatore epiteliale, E-caderina, delimita il GFP che esprimono popolazione di cellule epiteliali dal mesenchima circostante. Rilevazione della proteina membrana basale, perlecan, localizzata alla periferia dell'epitelio dimostra almeno parziale ricostituzione della membrana basale in ghiandole ricombinati. Figura 6. Parasimpatico gangli sottomandibolare sottoposti crescita dei neuriti e innervano le ghiandole nelle culture di ricombinazione, come dimostrato in precedenza 19.
Figura 1. (A) Diagramma di flusso e (B) Schema raffigurante le fasi principali sperimentali.
Figura 2. Brightfield immagini di (A) un giorno intero embrionale 13 (E13) ghiandola salivare che mostra l'epitelio ghiandola sublinguale (SL Epi) e l'epitelio ghiandola sottomandibolare (SMG Epi) circondata da mesenchima (MES). (B) Isolato rudimento epiteliale, e (C) Separato Mesenchima. Barre di scala = 100 micron.
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Figura 3. Immagini Brightfield di rudimenti epiteliali (indicato dalla linea tratteggiata bianca) circondato da pezzi mesenchima in coltura ex vivo per i tempi indicati. Le cellule epiteliali sono sottoposti ramificazione morfogenesi e la condensazione mesenchimali è evidente già dopo 24 ore di cultura. Barre di scala = 100 micron
Figura 4. Brightfield (A), fluorescente (B) e sovrapposti (C) immagini di SMGs ricombinati in cui sono stati infettati solo le cellule epiteliali (illustrato in linee bianche tratteggiate) con GFP-esprimenti adenovirus e coltivate ex vivo per 48 ore. Barre di scala = 100 micron.
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Figura 5. Immagini o immagini confocali campo chiaro (BF) di SMGs ricombinanti marcate con (A) nuclei (DAPI, blu), adenovirale GFP (verde), il marcatore epiteliale. E-caderina (rosso), barre di scala = 250 micron, oppure, (B) nuclei (DAPI, blu), adenovirale GFP (verde), il marcatore epiteliale, E-caderina (rosso), e il marcatore membrana basale, Perlecan ( ciano), barre di scala = 50 micron. Tratteggiate bianca contorno linee epitelio. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 6. Gangli parasimpatici sottomandibolare sottoposti crescita dei neuriti e innervano le ghiandole nelle culture di ricombinazione, barre di scala = 250 micron.
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Discussion
L'ex vivo epitelio-mesenchimale tecnica di ricombinazione è stato pubblicato per la sottomandibolare ghiandole salivari nel 1981 16. In questo protocollo, si ampliano il metodo originale, usando l'infezione adenovirale per manipolare cellule epiteliali espressione genica nel contesto di una ghiandola ricombinato. Abbiamo dimostrato che una percentuale delle cellule epiteliali sono infettati con l'adenovirus, mentre la percentuale di cellule che sono infettate dipende dalle proprietà del promotore virale, titolo virale e purezza virale. Abbiamo trovato che è necessario utilizzare gradiente di CsCl-virus purificate per trasduzione efficiente epiteliale, la purificazione di cui non è qui descritta. Poiché abbiamo anche potuto infettare le cellule mesenchimali prima ricombinazione (dati non mostrati), indipendente manipolazione genetica della popolazione mesenchimale è anche possibile. Abbiamo recentemente usato questo adenovirale trasfezione / tessuto ricombinazione metodo per identificare un ruoloper la proteina polarità, PAR-1b, nel controllo del posizionamento della membrana basale dell'epitelio da sviluppare in ghiandole salivari. Chinasi-morti PAR-1b adenovirus e wild-type PAR-1b adenovirus sono stati entrambi utilizzati in questo studio 13 a infettare rudimenti epiteliali e ricombinato con E13 mesenchymes. La possibilità di utilizzare virus mutanti per interrogare funzioni di molecole specifiche migliora notevolmente l'utilità di questo metodo.
Attualmente vi è una mancanza di strumenti efficaci per indirizzare specifiche molecole all'interno della popolazione di cellule epiteliali in intatti ghiandole salivari embrionali senza compromettere il vano mesenchimale. Anche se diversi studi hanno utilizzato inibitori farmacologici per manipolare trasduzione del segnale in colture d'organo intatti, questi inibitori influenzano sia l'epitelio e mesenchima. Per valutare direttamente effetti inibitori sulla epitelio, rudimenti epiteliali devono essere coltivate in assenza di uno o mesenchima in Matrigelr laminina-111 gel 6,7. Piccoli RNA inibitori (siRNA) sono un metodo efficace per down-regolare l'espressione genica epiteliale dal siRNA sono preferenzialmente assorbita dalle cellule epiteliali in presenza della maggior parte dei vettori lipidici 13,14,17,18. Tuttavia, nessuno di questi metodi per interferire con i livelli di proteine o funzione consentono sovraespressione di un gene wild-type o mutanti. I tentativi di trasfezione tradizionale (non virale) di colture embrionali SMG intere hanno avuto un successo limitato dal fatto che solo un piccolo numero di cellule epiteliali possono essere mirati (ML, dati non pubblicati). In confronto, la trasduzione adenovirale rappresenta un metodo efficace per la trasfezione salivari specificamente cellule epiteliali.
Parasimpatico hanno recentemente dimostrato di essere critica per il normale ghiandola salivare ramificazione mantenendo una cheratina 5-positivo popolazione di cellule progenitrici 19. Un vantaggio di questo metodo di ricombinazione tessuto sul mesenchyme privo epiteliale metodo di coltura rudimento è che il ganglio parasimpatico può essere mantenuta nel sistema di coltura ricombinazione. Tenendo traccia accurata della posizione approssimativa del ganglio parasimpatico, che si trova nel mesenchima adiacente al condotto primario epiteliale 19, è possibile garantire che ogni rudimento finisce per essere associato con un ganglio. Tuttavia, abbiamo trovato che combinando ghiandole 3-4 di valore di mesenchymes con ogni rudimento epiteliale, ogni rudimento è associato un ganglio sufficiente per innervare i germogli in una certa misura (figura 6), anche se non sempre alla stessa nel non modificato intatta ghiandole.
Esistono metodi alternativi per infettare l'epitelio nel contesto della ghiandola intatta. Abbiamo precedentemente riportato che microiniezione può essere utilizzato per introdurre adenovirus in cellule epiteliali in ghiandole intatti 20,21. Tuttavia, è difficile microiniezione controlo, possono danneggiare fisicamente le ghiandole, e porta normalmente a infezione localizzata solo un sottoinsieme di celle 20. Virus adeno-associati (AAV) hanno dimostrato di essere utili per la trasfezione delle distinte popolazioni cellulari nel contesto di espianti di organi intatti SMG 22. La scAAV2 sierotipo ha dimostrato di essere molto più efficiente a trasduzione specifica dell'epitelio del SMGs intatti oltre altri vettori AAV ricombinanti 23. Poiché AAV non sono ampiamente disponibili in commercio, né l'esperienza per preparare AAV esistere in molti laboratori, la trasduzione adenovirale e ricombinazione protocollo tessuto fornito qui è generalmente più accessibile alla maggior parte di laboratori è l'uso di vettori AAV.
Mentre questo metodo ricapitola ricombinazione tessuto epiteliale-mesenchimale interazioni certa misura, è anche possibile infettare l'epitelio con adenovirus e poi crescere l'epitelio di fuori del suo contesto originario.Come accennato in precedenza, abbiamo infettato intatte rudimenti salivari epiteliali con adenovirus e poi cresciuto culture in Matrigel con fattori di crescita esogena aggiunti 17,20,21. Salivari espianti di organi ghiandole possono anche essere coltivate su ponteggi nanofibre, anche se questi scaffold non ricapitolare la funzione completa del mesenchima nella loro forma attuale 15. Anche se nessuno di questi metodi ricapitola il mesenchima nativa, questi metodi consentono di imitazione di proprietà specifiche del mesenchima in coltura ex vivo.
Ogni metodo di coltura ex vivo ha i suoi vantaggi e svantaggi, ma è applicabile per affrontare specifiche questioni scientifiche. Mentre le ghiandole ricombinati non subiscono più ramificazione morfogenesi come fanno intatte salivari espianti di organi ghiandole, gli espianti di organi, in generale, solo ricapitolare in vivo branching morfogenesi per alcuni giorni. Una soluzione a questo problema è ovviamente di cremangiato animali transgenici contenenti l'espressione genica mirata all'interno del compartimento epiteliale. Dal momento che vi è una mancanza di promotori noti che si attivano specificamente nei primi mesi di sviluppo epitelio SMG, e la tecnologia transgenica rimane notevolmente più costosi rispetto ai metodi descritti, gli esperimenti di ricombinazione dei tessuti qui descritti costituiscono un efficace sistema modello per lo studio sia delle cellule epiteliali e mesenchimali di segnalazione in presto lo sviluppo di cellule delle ghiandole salivari nel loro contesto del tessuto.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Deirdre Nelson per gli utili commenti e per la lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni NIH DE019244, DE019197 e DE021841 a ML, F32DE02098001 di SJS e C06 RR015464 all'Università di Albany, SUNY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/Ham's F12 Medium without phenol red | Life Technologies | 21041-025 | |
| Penicillin and Streptomycin | Life Technologies | 15070-163 | 10X stock |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | Freeze single use aliquots at -20C |
| BSA | Sigma | A2934-100G | Fraction V, low endotoxin |
| Adeno-X-GFP | BD Biosciences | 8138-1 | Should be high titer (1x1010 pfu/ml). CsCl purified viruses are more effective than column-purified viruses in this assay. |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Diluted to 2% in PBS with 5% sucrose (w/v) |
| 1X Phosphate-buffered saline (PBS) | Life Technologies | 70011-044 | Prepared from 10X stock |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14175095 | no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red |
| Transferrin | Sigma | T8158 | 25 mg/ml stock solution in DMEM/F12 media. Freeze single-use aliquots at -20C |
| L- Ascorbic acid (Vitamin C) | Sigma | A4403 | 75 mg/ml stock solution in DMEM/F12 media.Freeze single-use aliquots at -20C |
| Table 1. List of reagents required for SMG recombination protocol. | |||
| 10 cm sterile plastic dishes | Corning | 430167 | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| Stereo dissecting microscope with transmitted light base | Nikon | SMZ645 | Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base. |
| 35 mm tissue culture dishes | Falcon | 353001 | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| 50 mm diameter microwell dishes | MatTek Corporation | P50-G-1.5-14F | |
| Nuclepore Track-Etch membrane filters | Whatman | 110405 | 13 mm diameter, 0.1 mm pore size |
| Widefield fluorescence microscope | Carl Zeiss, USA | Axio Observer Z1 | Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera. |
| Confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used. |
| Timed-pregnant female mice, strain CD-1 or ICR | Charles River Labs | Embryos are harvested on day 13 (with day of plug discovery designated as day 0). | |
| Scalpel blade #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Dumont #5 forceps inox alloy, 0.05mm X 0.02mm | Fine Science Tools | 11252-20 | Ideal for harvesting glands from embryos |
| Dumont #5 forceps dumostar alloy, 0.05mm X 0.01mm | Fine Science Tools | 11295-20 | Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used. |
| Table 2. Equipment used in SMG recombination protocol. | |||
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