Visualização de mRNAs retículo endoplasmático localizados em células de mamíferos

Summary

Descrevemos aqui um método para visualizar retículo endoplasmático associadas mRNAs em células de cultura de mamífero de tecidos. Esta técnica envolve a permeabilização selectiva da membrana plasmática com digitonina para remover conteúdo citoplasmático seguido fluorescente In situ Hibridação para detectar ou poli granel (A) mRNA ou transcritos específicos.

Abstract

Nos eucariotas, a maioria dos RNAs mensageiros (mRNAs), que codificam proteínas de membrana e segregadas são localizados na superfície do retículo endoplasmático (ER). No entanto, a visualização destes mRNAs pode ser um desafio. Isto é especialmente verdadeiro quando apenas uma fracção do mRNA é ER-associado e a sua distribuição a esta organela é obstruída por não-segmentados (isto é, "livre") transcrições. A fim de controlar ER-associados mRNAs, foi desenvolvido um método no qual as células são tratadas com uma exposição de curta duração a uma solução de extracção que digitonina permeabilizes selectivamente a membrana do plasma e, portanto, remove o conteúdo citoplasmático, mantendo simultaneamente a integridade do ER . Quando este método é acoplado com hibridação in situ fluorescente (FISH), pode-se visualizar claramente ER-bound mRNAs por microscopia de fluorescência. Usando este protocolo o grau de ER-associação, quer para a granel de poli (A) ou transcritos de ARNm específicos podem ser avaliadose ainda quantificado. No processo, pode-se utilizar este teste para investigar a natureza do mRNA do ER-interacções.

Introduction

Nos eucariotas, a codificação de mRNA e proteínas da membrana secretada pode ser orientada para o ER por co-tradução do sinal de reconhecimento ^1,2 partícula e pode ser mantido no ER via das interacções directas entre os ribossomas e translocons durante a tradução ^3,4. No entanto, se mRNAs podem ser direcionados e mantido na ER independente de ou ribossomos ou a tradução não estava claro até muito recentemente. Estudos anteriores tentaram abordar se há tradução independente de associação com o mRNA ER utilizando técnicas de fraccionamento celular. Como as condições químicas severas eram necessárias para desassociar ribossomos de ER vesículas der....

Protocol

1. Preparação de Materiais para extracção

1. Preparação de Células
   1. Semente células de cultura de tecidos tratados com ácido sobre lamelas durante pelo menos um dia antes da experiência. Usamos COS-7 ou U2OS, como estas duas linhas de células exibem robusta de produção de proteína segregada e tem um ER bem definida. Note-se que para obter a eficiência de extracção elevado, as células não deve exceder 80% de confluência no lamela no dia da experiência.
   2. Se um mRNA específico exógeno está a ser investigada, as células são transfectadas um dia após a sementeira com plasmídeos contendo o gene de interesse, utilizando protocolos de transfecção con....

Results

Para determinar a percentagem de mRNA que é ER-associado, células COS-7 que foram transfectadas com os plasmídeos que continham a fosfatase alcalina de placenta (ALPP) ou citocromo P450-8b1 (CYP8B1) ou foram extraídas com digitonina e, em seguida, fixo, ou fixo directamente (ver Figura 1, comparar "não extraído Ctrl" para "Extraído Ctrl"). A fluorescência não nuclear foi quantificada em ambas as amostras e a fracção de ER-associated mRNA foi calculado (Figura 2). Os no.......

Discussion

A localização dos mRNAs para vários locais subcelulares, através da interacção com proteínas de transcritos de mRNA de localização, é um fenómeno generalizado importante para a triagem adequada de proteínas para o seu destino final, e para o ajuste fino da expressão de genes com os requisitos locais de uma subcelular região ^19,20.

Utilizando o ensaio aqui descrito, revisitamos a questão de se os ARNm que codificam para proteínas de secreção pode ser mantida no ER na presença ou au.......