C. elegans Chemotaxis Assay

Resumo

Um método para avaliar quantitativamente a resposta quimiotáctica de Caenorhabditis elegans É descrito. Um índice quimiotáctico (Cl) foi utilizada como uma forma de avaliar precisamente a resposta de minhocas, para determinados objectivos, e servir como uma plataforma de comparação entre estirpes e os compostos de interesse.

Resumo

Muitos organismos usam a quimiotaxia para buscar fontes de alimentos, evitar substâncias nocivas, e encontrar companheiros. Caenorhabditis elegans tem comportamento quimiotaxia impressionante.

A premissa subjacente testar a resposta dos vermes a um odorante é colocá-los em uma área e observar o movimento evocada em resposta a um odorante. Mesmo com os diversos ensaios disponíveis, optimizando verme localização inicial em relação a ambas as áreas de teste e de controlo, enquanto minimiza a interacção de vermes com o outro, mantendo ao mesmo tempo uma amostra significativa, continua a ser um trabalho em progresso ^1-10. O método descrito aqui pretende abordar estas questões através da modificação do ensaio desenvolvido por Bargmann et al. ^1. A placa de Petri é dividido em quatro quadrantes, dois quadrantes opostos marcados "teste" e dois são designados como "Controle". Anestésico é colocado em todos os testes e os locais de controlo. Os vermes são colocados no centro da placa com uma circle marcados em torno da origem para assegurar que os vermes não-móveis serão ignorados. Utilizando um sistema de quatro quadrantes, em vez de um ou 2 dois elimina uma polarização no movimento dos vermes, como eles são equidistantes a partir de amostras de ensaio e de controlo, independentemente de que lado da origem começaram. Isso contorna o problema de vermes sendo forçados a viajar através de um conjunto de outros vermes para responder a um odorante, o que pode atrasar vermes ou forçá-los a tomar um caminho mais tortuoso, produzindo uma interpretação errada do seu caminho pretendido. Este método também apresenta vantagens práticas por ter um tamanho de amostra maior e permitindo que o pesquisador para executar o ensaio autônoma e marcar os vermes uma vez que o tempo estipulado expirou.

Introdução

Ward desenvolvido pela primeira vez o ensaio de quimiotaxia em 1973 ^5, e desde então tem tido aplicações de longo alcance. Neurobiology é um campo que beneficiou de utilizar uma variedade de ensaios de quimiotaxia. Adaptação olfativo, uma simples forma de aprendizagem e memória, foi demonstrada em C. elegans usando ensaios de quimiotaxia ^6. Eles também têm sido usados ​​para mostrar que a C. elegans pode desenvolver-etanol tolerância resultado demonstra que não só a plasticidade comportamental dos vermes, mas que também mostra que os vermes podem ser muito útil no estudo da dependência do álcool em humanos ^3. Os ensa....

Protocolo

1. Preparação / lavar os Worms

1. Sincronizar vermes adultos jovens ^11.
2. Pipetar 2 ml da Basal S em uma placa de 5 cm de Chemotaxis encenado vermes que só limpou o gramado do OP50 E. coli. Incline a placa conforme necessário para garantir que os vermes são lavados da superfície da placa para o buffer.
3. Pipete 1 mL de solução de Basal verme-S para um tubo de microcentrífuga.
4. Centrifugar durante 10 segundos usando um PicoFuge em 6600 rpm.
5. Aspirar o Basal S, deixando a pelota de vermes não perturbadas.
6. Adicionar 1 ml de solução de S basal ao tubo de microcentrífuga, invertido várias vezes para l....

Resultados

Comparando-se o tipo selvagem (N2) C. elegans para o ODR-10 (KY10) mutante.

Usamos diacetil, um conhecido C. elegans quimioatractor, para comparar os vermes de tipo selvagem para o de um mutante que carece do receptor para diacetil ^1,12. Por tipo selvagem (N2), o índice quimiotáctico vermes era de 0,100 ± 0,066 para o etanol, e 0,839 ± 0,031-0,5% de diacetil. Como esperado, diacetil provoca uma resposta significativa quimioatratante de vermes de ti.......

Discussão

Quimiotaxia, embora controladas por um conjunto complexo de mecanismos neuronais e celulares, pode ser facilmente e objectivamente quantificada usando ensaios de quimiotaxia. Para obter os melhores resultados a partir dos ensaios, devem ser tomadas determinadas etapas críticas. Em primeiro lugar, encenando os vermes é essencial para dar resultados experimentais consistentes. Worms em diferentes fases da vida se comportam de forma diferente ^13; vermes estágio tão misturada pode distorcer os resultados experime.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
S Basal (- colesterol) [5,8 g NaCl; 1 M K fosfato de potássio, tampão pH 6,0; dH2O até 1 litro.] Autoclave
PicoFuge	Stratagene	400552
Microscópios	Leica
Dissecando	Leica
Pipeta P1000	Gilson
Pipeta P10	Gilson
0,5 M Azide de Sódio
Ágar de Quimiotáxis [1,6% BBL-ágar (Benton-Dickinson) ou 2% Difco-ágar. Autoclave. Adicione 5 mM fosfato de potássio, pH 6,0; 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4]
Álcool Etílico/Água Destilada
Compostos de Teste (por exemplo, 0,5% diacetil)
Ágar	Bio-Rad	166-0600
NH4Cl	Amresco	CA97062-046
MOPS	VWR	CA12001-120
NH4OH	BDH	CABDH8641-2
0,25% Tween 20	Bio-Rad	170-6531