C. elegans Chemotaxis Assay

Resumo

Um método para avaliar quantitativamente a resposta quimiotáctica de Caenorhabditis elegans É descrito. Um índice quimiotáctico (Cl) foi utilizada como uma forma de avaliar precisamente a resposta de minhocas, para determinados objectivos, e servir como uma plataforma de comparação entre estirpes e os compostos de interesse.

Resumo

Muitos organismos usam a quimiotaxia para buscar fontes de alimentos, evitar substâncias nocivas, e encontrar companheiros. Caenorhabditis elegans tem comportamento quimiotaxia impressionante.

A premissa subjacente testar a resposta dos vermes a um odorante é colocá-los em uma área e observar o movimento evocada em resposta a um odorante. Mesmo com os diversos ensaios disponíveis, optimizando verme localização inicial em relação a ambas as áreas de teste e de controlo, enquanto minimiza a interacção de vermes com o outro, mantendo ao mesmo tempo uma amostra significativa, continua a ser um trabalho em progresso ^1-10. O método descrito aqui pretende abordar estas questões através da modificação do ensaio desenvolvido por Bargmann et al. ^1. A placa de Petri é dividido em quatro quadrantes, dois quadrantes opostos marcados "teste" e dois são designados como "Controle". Anestésico é colocado em todos os testes e os locais de controlo. Os vermes são colocados no centro da placa com uma circle marcados em torno da origem para assegurar que os vermes não-móveis serão ignorados. Utilizando um sistema de quatro quadrantes, em vez de um ou 2 dois elimina uma polarização no movimento dos vermes, como eles são equidistantes a partir de amostras de ensaio e de controlo, independentemente de que lado da origem começaram. Isso contorna o problema de vermes sendo forçados a viajar através de um conjunto de outros vermes para responder a um odorante, o que pode atrasar vermes ou forçá-los a tomar um caminho mais tortuoso, produzindo uma interpretação errada do seu caminho pretendido. Este método também apresenta vantagens práticas por ter um tamanho de amostra maior e permitindo que o pesquisador para executar o ensaio autônoma e marcar os vermes uma vez que o tempo estipulado expirou.

Introdução

Ward desenvolvido pela primeira vez o ensaio de quimiotaxia em 1973 ^5, e desde então tem tido aplicações de longo alcance. Neurobiology é um campo que beneficiou de utilizar uma variedade de ensaios de quimiotaxia. Adaptação olfativo, uma simples forma de aprendizagem e memória, foi demonstrada em C. elegans usando ensaios de quimiotaxia ^6. Eles também têm sido usados ​​para mostrar que a C. elegans pode desenvolver-etanol tolerância resultado demonstra que não só a plasticidade comportamental dos vermes, mas que também mostra que os vermes podem ser muito útil no estudo da dependência do álcool em humanos ^3. Os ensaios têm mesmo sido desenvolvidos para demonstrar a capacidade de C. elegans para armazenar curto e memória de longo prazo, mostrando que as associações são feitas pelos vermes entre chemoattractants e Alimentação (OP50) ^7. Além disso, dada a extensa informação actualmente disponível sobre o C. elegans do genoma, o chemotaxiO comportamento de C. elegans foi alterada várias vezes através da indução de mutações de ^1,8. Isto permite muitas possibilidades interessantes de engenharia, tais como o desenvolvimento de C. elegans como uma ferramenta de biorremediação. Assim, uma vez que o desenvolvimento inicial do ensaio de quimiotaxia, em 1973, tem sido frequentemente alterado e utilizado para elucidar mistérios numa variedade de áreas.

Alguns ensaios teve como objetivo descobrir a rota específica tomada pelos vermes em direção a um alvo. O ensaio protótipo deste tipo foi desenvolvido por Ala ^5. Três vermes foram colocados em agar derretido, durante 15 min. Os seus movimentos foram rastreados pelo cunho eles deixados como explorada a partir da periferia da placa superior de um gradiente de um atraente no centro da placa. Todos os vermes na placa foram presos utilizando clorofórmio no final de cada ensaio. Um descendente deste método de um único sem-fim colocado no meio da placa com o atractivo e a um controlet distâncias iguais e opostas a partir da origem ^2.

Pierce-Shimomura et al. desenvolvido um ensaio para observar a natureza exacta do movimento envolvidos na quimiotaxia ^9. Vermes individuais foram colocados em placas de Petri de 9 centímetros, quer contendo uma concentração uniforme do atraidor ou um gradiente de forma radial, que culminou com a fonte do atraidor. Um programa de computador que reconhece o worm foi usado para registrar o comportamento observado. Uma câmara de vídeo acoplada a um microscópio trabalhadas em conjunto com a fase de ajustar a placa de Petri automaticamente como o ensaio correu para assegurar o verme permaneceu no campo de visão. A partir daí, a informação mais detalhada foi descoberto em relação à causa de pirueta indicadas por C. elegans.

Outros ensaios, mais semelhantes ao descrito aqui, testou a resposta de uma grande população de vermes para compostos de teste. Dois quadrantes ensaios de quimiotaxia foramutilizada para explorar as funções que vários receptores, neurónios, e as moléculas de transdução de sinal quando reproduzido C. elegans foi exposto a vários compostos ^1. Entre 20-50 vermes lavados foram colocados perto do centro da placa com um atraente e um controle nas extremidades polares, juntamente com o anestésico, azida de sódio _(NaN3). Após 60 min, um índice quimiotáctico com valores a partir de -1,0 a +1,0 foi gerado com base na diferença entre o número de vermes foram afixadas no atractivo ou o controlo. Um índice quimiotáctico semelhante foi usada no ensaio relatado neste artigo, embora o ensaio anterior falhou para avaliar rigorosamente vermes não-móveis. Este ensaio foi posteriormente aplicada a testar os efeitos de ablação neuronal em quimiotaxia.

Outra variação do ensaio acima mencionado foi realizada 100-200 vermes onde foram colocados no centro de uma placa contendo quatro quadrantes ^3. Quadrantes adjacentes ou o teste, ou contidocontrolar a substância. Tal como nos ensaios anteriores, os vermes foram imobilizadas por acção de azida de sódio, antes de serem marcados. Um método semelhante é descrito aqui como uma forma de avaliar a resposta de C. elegans para vários compostos. No entanto, o método abaixo tem a vantagem de apenas avaliar vermes que passaram uma distância limite que separa móvel de vermes imóveis.

Outros ensaios incorporaram diretrizes semelhantes para ignorar vermes imóveis. Frøkjær-Jensen et ai. desenvolvido um ensaio versátil que pode ser usado para testar os compostos solúveis tanto voláteis e água ^10. A placa de Petri foi dividida em quatro quadrantes. Os quadrantes superior e inferior não contêm solventes. O quadrante esquerdo continha água, eo direito continha o atrativo. Ao testar odorantes voláteis, o analito foi colocado sobre a tampa da cápsula, ao longo do quadrante correcto, enquanto que os compostos solúveis em água, foram colocadas directamente no agar.

Os métodos actualmente existentes para avaliar a resposta quimiotáctica de C. elegans estão constantemente a ser refinado para optimizar a sua facilidade de uso, a eficiência e precisão. Assim, enquanto que o ensaio aqui descrito tem a capacidade de avaliar um maior número de vermes (máximo rendimento:. Vermes 250 / hora por placa, um pouco maior do que a taxa de transferência demonstrada por Lee et al, ^3), a força real deste método é o sucinta culminar de muitos dos atributos dos ensaios anteriores (Tabela 1).

Protocolo

1. Preparação / lavar os Worms

1. Sincronizar vermes adultos jovens ^11.
2. Pipetar 2 ml da Basal S em uma placa de 5 cm de Chemotaxis encenado vermes que só limpou o gramado do OP50 E. coli. Incline a placa conforme necessário para garantir que os vermes são lavados da superfície da placa para o buffer.
3. Pipete 1 mL de solução de Basal verme-S para um tubo de microcentrífuga.
4. Centrifugar durante 10 segundos usando um PicoFuge em 6600 rpm.
5. Aspirar o Basal S, deixando a pelota de vermes não perturbadas.
6. Adicionar 1 ml de solução de S basal ao tubo de microcentrífuga, invertido várias vezes para lavar os vermes.
7. Repita os passos 1.4 a 1.6 mais três vezes.
8. Centrifugue durante 10 segundos a quinta vez, desta vez aspirando o sobrenadante para um volume final de ca. 100 ul.
9. Pipeta 2 ul dos vermes numa placa NGM para garantir que há entre 50 e 250 vermes em cada amostra de 2 ul. Ajustara concentração de vermes no basal S conforme necessário por ressuspensão dos vermes em um volume maior ou menor de S basal.
10. Usar os vermes no ensaio imediatamente após a lavagem dos vermes para até 1 hora.

2. Preparar as placas de teste

1. Marcando o lado de baixo de uma placa de 5 cm, dividir o prato em quatro quadrantes iguais. Pode ser utilizado ou ágar Quimiotaxia NGM. Um mínimo de três ensaios são necessários por estirpe genética a ser testado.
2. Marque um círculo com um raio de 0,5 centímetros em torno da origem (figura 1).
3. Marcar um ponto em cada quadrante com qualquer um "T" para "Test" ou "C" para "Control", garantindo que os sites estão equidistantes da origem e outro. Os pontos devem ser pelo menos 2 cm de distância da origem. Marcar o canto superior esquerdo e inferior direito quadrantes como quadrantes teste e no canto superior direito e inferior esquerdo quadrantes como controles (Figura 1).

3. A execução do ensaio

1. Misturar a solução de ensaio através da combinação de volumes iguais de o composto de teste e 0,5 M azida (um anestésico usado para prender os vermes ao atingir um quadrante). Misturar a solução de controlo, combinando o solvente utilizado para diluir o composto de teste, com 0,5 M de azida.
2. Pipeta 2 ul da solução de verme (preparado em 1.8) a partir da pelota para a origem (onde as duas linhas se cruzam).
3. Imediatamente depois, pipeta 2 mL da solução de ensaio para os dois locais de "T". Da mesma forma, pipetar a mesma quantidade da solução de controlo para os dois locais de "C".
4. Uma vez que os vermes e odorante gotas foram absorvidas no agar, substituir as tampas e inverter as placas.
5. Após 60 min, coloque os vermes numa incubadora de 4 ° C. Apenas remover uma placa da incubadora, quando pode ser contado. Partindo vermes, à temperatura ambiente, pode permitir a mobilização de novo.
6. Anote o número de vermes em cada quadrante que cruzou completamente a circ interiorle.
7. Repita os passos 3.2 a 3.6, utilizando a solução de controlo em ambos os quadrantes de ensaio e de controlo. Isto servirá como a placa de controlo. Três dessas placas devem ser feitas e correr para servir como um controle adequado.

4. Interpretando os Scores / determinação do índice de quimiotaxia

1. Calcular o índice de quimiotaxia usando a Equação 1. Isso vai render um índice quimiotático entre -1,0 e 1,0.

(1)

Quimiotaxia Index = (# Worms em ambos os quadrantes do teste - # Worms em ambos os quadrantes Controle) / (N º total de gols Worms)

Uma pontuação de 1,0 indica atracção máxima em direcção ao alvo e representa 100% dos vermes que chegam nos quadrantes contendo o alvo química. Um índice de -1,0 evidência de repulsão máxima. Métodos de ensaio semelhantes foram já empregues ³ (Tabela 1).

2. Indicar a média Chemotaxis Index (CI) e erro padrão da média (SEM). Realizar o t-teste de Student comparando os dados a partir das placas de ensaio e de controlo.

Resultados

Comparando-se o tipo selvagem (N2) C. elegans para o ODR-10 (KY10) mutante.

Usamos diacetil, um conhecido C. elegans quimioatractor, para comparar os vermes de tipo selvagem para o de um mutante que carece do receptor para diacetil ^1,12. Por tipo selvagem (N2), o índice quimiotáctico vermes era de 0,100 ± 0,066 para o etanol, e 0,839 ± 0,031-0,5% de diacetil. Como esperado, diacetil provoca uma resposta significativa quimioatratante de vermes de ti...

Discussão

Quimiotaxia, embora controladas por um conjunto complexo de mecanismos neuronais e celulares, pode ser facilmente e objectivamente quantificada usando ensaios de quimiotaxia. Para obter os melhores resultados a partir dos ensaios, devem ser tomadas determinadas etapas críticas. Em primeiro lugar, encenando os vermes é essencial para dar resultados experimentais consistentes. Worms em diferentes fases da vida se comportam de forma diferente ^13; vermes estágio tão misturada pode distorcer os resultados experime...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
S Basal (- colesterol) [5,8 g NaCl; 1 M K fosfato de potássio, tampão pH 6,0; dH2O até 1 litro.] Autoclave
PicoFuge	Stratagene	400552
Microscópios	Leica
Dissecando	Leica
Pipeta P1000	Gilson
Pipeta P10	Gilson
0,5 M Azide de Sódio
Ágar de Quimiotáxis [1,6% BBL-ágar (Benton-Dickinson) ou 2% Difco-ágar. Autoclave. Adicione 5 mM fosfato de potássio, pH 6,0; 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4]
Álcool Etílico/Água Destilada
Compostos de Teste (por exemplo, 0,5% diacetil)
Ágar	Bio-Rad	166-0600
NH4Cl	Amresco	CA97062-046
MOPS	VWR	CA12001-120
NH4OH	BDH	CABDH8641-2
0,25% Tween 20	Bio-Rad	170-6531