Teste de microtração ambientalmente controlado mecanicamente adaptativas nanocompósitos poliméricos para Ex vivo Caracterização

Summary

Um método pelo qual é discutida a In vivo Comportamento mecânico dos materiais que respondem a estímulos é monitorizada como uma função do tempo. As amostras são testadas Ex vivo Utilizando um aparelho de microtração com controles ambientais para simular o ambiente fisiológico. Este trabalho promove ainda mais a compreensão do In vivo Comportamento do nosso material.

Abstract

Microdispositivos implantáveis ​​estão ganhando atenção significativa para diversas aplicações biomédicas ^1-4. Tais dispositivos têm sido feitas a partir de uma variedade de materiais, cada um deles oferecendo as suas próprias vantagens e deficiências ^5,6. Mais importante ainda, devido às dimensões do dispositivo de microescala, é exigido um elevado módulo de elasticidade para facilitar o implante em tecidos vivos. Por outro lado, a rigidez do dispositivo deve coincidir com o tecido circundante para minimizar a tensão induzida locais ^7-9. Por isso, desenvolveu recentemente uma nova classe de materiais bio-inspirados para atender a esses requisitos, respondendo aos estímulos do ambiente, com uma mudança nas propriedades mecânicas ^10-14. Especificamente, o nosso nanocompósito com base em (acetato de vinilo) poli (PVAc-NC) mostra uma redução na rigidez, quando expostos à água e temperaturas elevadas (por exemplo, temperatura corporal). Infelizmente, existem alguns métodos para quantificar a rigidez dos materiais in vivo ¹⁵ e mecanismotestes mecânicos fora do ambiente fisiológico requer frequentemente grandes amostras inadequado para a implantação. Além disso, os materiais de estímulos-resposta pode recuperar rapidamente a sua rigidez inicial após remoção. Por conseguinte, temos desenvolvido um método através do qual as propriedades mecânicas de microamostras implantadas pode ser medida ex vivo, com as condições fisiológicas simuladas mantida utilizando controlo de temperatura e humidade ^13,16,17.

Para este efeito, um aparelho de teste de microtração costume foi concebido para acomodar amostras microescala ^13,17 com muito variados módulos de Young (intervalo de 10 MPa a 5 GPa). Como os nossos interesses estão no pedido de PVAc-NC como substrato sonda neural biologicamente adaptável, uma ferramenta mecânica capaz de caracterização de amostras em microescala era necessário. Esta ferramenta foi adaptado para fornecer humidade e controlo da temperatura, o que minimiza a secagem e arrefecimento da amostra ^17. Como resultado, o mecânicocaracterísticas da amostra al explantada refletir atentamente aqueles da amostra pouco antes de explante.

O objetivo geral deste método é avaliar quantitativamente a nas propriedades mecânicas in vivo, especificamente o módulo de Young, de matérias estímulos-resposta, mecanicamente adaptativo polímero à base. Isto é conseguido através do estabelecimento de primeiro as condições ambientais que minimizem uma mudança na amostra propriedades mecânicas após o explante, sem contribuir para a redução da rigidez independente da que resulta da implantação. As amostras são, então, preparado para o implante, o manuseamento, e ensaio (Figura 1A). Cada amostra é implantado no córtex cerebral de ratos, que está aqui representado como um cérebro de rato explantado, por um período especificado (Figura 1B). Neste ponto, a amostra é explantado e imediatamente carregadas no testador microtração, e, em seguida, submetido a ensaios de tracção (Figura1C). Posterior análise de dados fornece insights sobre o comportamento mecânico destes materiais inovadores no ambiente do córtex cerebral.

Protocol

1. Preparação da Amostra

1. Prepare a película de PVAc-NC de espessura na gama de 25-100 mM, utilizando uma técnica de moldagem em solução e compressão ^10-12.
2. Aderem filme a uma pastilha de silício, por aquecimento sobre uma placa quente durante dois minutos, a 70 ° C (acima da temperatura de transição de vidro) a promover um contacto íntimo entre a película e a bolacha. Este passo assegura que a película preparada permanece estável e fixo para a bolacha de Si, o que é necessário para os processos microtorneamento planares.
3. Padrão do filme na amostra geometrias teste de-micro-usinagem a laser (VLS 3,50, VersaLASER). Defina os _dois parâmetros de micro-usinagem a laser direto escrever CO para 1,0% de energia (0,5 W), a velocidade de 4,0% (56 mm / s), e 1000 pulsos por polegada ^13,16.
4. Amostras padrão que serão utilizados para estabelecer as condições ambientais ("amostras de configuração") em estruturas dogbone em forma de almofada com as dimensões laterais de 1,5 x 1,5 mm ^2, e feixe lateral, dimensões 300 x 3000 mM ^2, com uma espessura correspondente que ao longo do filme (Figura 2).
5. Padrão das amostras para as experiências ex vivo ("Amostra de implante") em vigas 300 mm x 6 mm, com uma espessura correspondente ao do filme.
6. Libertar cuidadosamente as amostras a partir da bolacha usando uma lâmina de barbear e uma pinça.
7. Para o manuseio da amostra, preparar os titulares de acrílico personalizado usinados destinados a servir como parte do sistema de aderência no testador de microtração. Marcações gravadas a laser mostram a linha central do suporte e 1,5 mm a partir da extremidade. Colocar uma pequena quantidade de adesivo à base de gel de cianoacrilato sobre a linha central do suporte de acrílico e aderir cuidadosamente mm de comprimento da amostra 1,5 implante ao detentor e sobrepor-se à linha de centro (fig. 3). Cada amostra de implante requer um suporte de acrílico. Tenha o cuidado de garantir que o gel adesivo permanece apenas ao longo do comprimento mm de PVAc-NC 1.5 sendo respeitado o acrtitular ylic. Caso contrário, o gel adesivo podem interferir com o comportamento mecânico da amostra.
8. Remover humidade de todas as amostras colocando-as num exsicador durante pelo menos 24 horas.
9. Medir o comprimento, largura, espessura e as dimensões das amostras usando um microscópio óptico.

2. Estabelecer Condições Ambientais

1. Carregar um extracto seco de configuração para o testador microtração (ver Figura 4), ​​o primeiro aperto entre as garras móveis, em seguida, entre as garras fixas.
2. Montar uma escova de ar, com um reservatório cheio de água, para uma posição fixa, com o bocal voltado para a amostra microtração. Ligue a escova de ar de um compressor de ar através de tubos de plástico. Com o bocal de escova de ar completamente fechada, ligar o compressor de ar.
3. Comece procedimento de teste de microtração cíclico, alternando entre a tensão de tração (tensão positiva) e tensão de compressão (pressão negativa) aplicada a tele amostra, mantendo-se dentro da região elástica linear da trama de tensão-deformação. Para PVAc-NC, a estirpe aplicada é limitada a menos do que 2%. Nas testador microtração costume utilizado nestas experiências, a velocidade de deformação foi controlada enquanto que a força necessária para conseguir essa estirpe foi medido. Alternativamente, uma configuração diferente pode envolver o controlo da força aplicada durante a medição da tensão resultante.
4. Aumentar gradualmente o fluxo a partir do bocal escova de ar, e monitorizar o declive do gráfico de tensão-deformação em função da quantidade de fluxo a partir da escova de ar. O fluxo máximo que não cause uma redução significativa (> 10%) no módulo de elasticidade ao longo de um período de 60 segundos é o nível que será utilizada para as experiências ex vivo. Neste ponto, as condições de humidade que não seja molhada de uma amostra seca (e, assim, contribuir para uma redução no módulo de Young) e também minimizar a amostra de secagem depois de ser exposto aos fluidos biológicos in vivo têm sido ESTAcida.
5. Medir a temperatura próxima da amostra. Uma configuração ideal seria incluir um termopar com leitura digital, e ser executada enquanto o aerógrafo está operando. Definir a intensidade e da distância da fonte de calor radiante de tal modo que a temperatura da amostra é mantida a 37 ° C, para se adequar às condições fisiológicas.

3. Compare Controle Ambiental para Controle de Não-Ambiental

1. As amostras adicionais para Imergir pelo menos 30 min em solução salina tamponada com fosfato. Após este período de tempo, a amostra é completamente saturada e foi reduzido para o seu valor mínimo do módulo de Young, a uma dada temperatura.
2. Carregar rapidamente uma amostra para o testador de microtração e começar os testes de microtração cíclica, com o air brush off, enquanto seca a amostra. Isso vai determinar a rapidez com que a secagem da amostra em condições não controladas.
3. Coloque uma segunda amostra de configuração PBS-saturada no testador de microtração, e começar os testes de microtração cíclicacom a escova de ar ligado. Isso vai determinar a rapidez com que a seca de amostra em condições ambientais controladas.

4. Implantação da sonda e explantes

1. Anexar amostra implante a um micromanipulador braçadeira e da posição ortogonal para o tecido cortical.
2. Antes da inserção, manter o tecido suficientemente úmido com solução salina para garantir a homogeneidade da mecânica de tecido.
3. Diminuir a amostra de polímero para o córtex utilizando os comandos manuais micromaniplador. Adicione amostra no tecido cortical até que o tempo de implante de destino, em geral, entre 1 e 30 min. Para evitar que o tecido de secagem para os momentos mais 5 min, levemente dab o tecido a cada 5 minutos com um cotonete embebido em soro fisiológico.
4. Enquanto a sonda estiver implantada no córtex, preparar o aparelho de teste de microtração para o carregamento da amostra actualmente implantado, definindo a haste de condução para a posição zero de deslocamento de 3,0 mm a partir da braçadeira amostra estacionária. Além disso, defina o bocal de escova de arpara o ajuste do fluxo e da fonte de calor radiante para determinar a intensidade adequada no passo 2.4.
5. No final do tempo de implante especificado, elevar a sonda do córtex utilizando os comandos manuais micromaniplador. Imediatamente, e cuidadosamente, remover a amostra da braçadeira micromanipulador e carregar para o testador microtração, tal como descrito em mais pormenor no passo 5.2.

5. Teste de microtração de amostras de implantes

1. Para poupar tempo, após o explante, assegurar que o testador microtração é completamente pronto para aceitar a amostra de implante antes da implantação, tal como descrito na etapa 4.4.
2. Imediatamente após explante, coloque a amostra entre os dois conjuntos de grampos testador microtração. Uma vez que a amostra é montada num suporte de acrílico concebido para servir como a metade superior de uma pinça, o lugar de montagem da amostra sobre o implante o aperto, do lado da amostra celular baixo. É importante assegurar que a amostra é montada de tal modo que a tensão é aplied apenas ao longo do comprimento da sonda a fim de evitar a aplicação de binário à amostra durante o teste. Como tal, a amostra tem de ser montado ao centro de cada grampo, e as pinças devem ser nivelada em relação uns aos outros.
3. Ajustar a posição da amostra de tal modo que a distância entre as pinças é 3,0 mm, e a extremidade da sonda é colocada no grampo fixo. Este comprimento de 3,0 milímetros entre as braçadeiras é o comprimento de medida para a amostra, e será utilizado nos cálculos posteriores para determinar a pressão sobre a amostra.
4. Imediatamente após a obtenção da amostra entre as duas pinças, e dentro de 2 min de explante a partir do tecido neural, activar o motor na direcção de tracção para alongar a amostra a uma taxa constante (10 um / s usados ​​aqui), enquanto que, simultaneamente, a medição e registo alongamento da amostra (através de um indicador de deslocamento, Mitutoyu 543-561) e força associada (usando uma célula de carga, Técnicas de Transdutores MDB-2.5) necessária para esticar a amostra.
6. Repetir o teste de microtração para cada amostra e / ou cada conjunto de condições (ou seja, tempo de inserção).

6. Análise de Dados

1. Converter os dados brutos de alongamento a uma tensão de engenharia aplicada ao implante amostra dividindo a distância de alongamento pelo comprimento do calibre inicial, como descrito na Equação 1, onde a estirpe está ε aplicada, t é o tempo, d é o deslocamento medido pelo micrómetro indicador, e L ₀ é o comprimento inicial de medida da amostra:
   (1)
2. Converter os dados de força bruta para a tensão de projecto na amostra dividindo a força (em Newtons), por traárea da secção transversal nsverse, como descrito na Equação 2:
   (2)
   onde σ é a tensão sobre a amostra, F é a força medida pela célula de carga (em Newtons), ₀ w é a largura inicial da amostra, e t é ₀ a espessura inicial da amostra.
3. Traçar a tensão (σ [t]) versus tensão (ε [t]) curva para cada amostra, utilizando um programa de computador, como o Microsoft Excel.
4. Isolar a parte elástica linear da trama e usar as ferramentas de ajuste de curva baseada em software para encontrar a melhor linha de ajuste a esta parte. A inclinação da linha de melhor ajustamento corresponde ao módulo de elasticidade da amostra. A porção isolada da trama deve incluir pelo menos 10 pontos de tensão-deformação, e deve ser feita a partir da porção da trama, onde a inclinação é maior.
5. Para os testes cíclicos, o módulo de Young vai precisar de ser determinado para cada ciclo. Isto pode ser realizado manualmente ou automatizados.
6. Para todos os ensaios cíclicos, plot o módulo de Young de cada ciclo em relação ao tempo. Isso indica como a variação do módulo de medição com o tempo, o que é indicativo de quão rapidamente uma amostra de configuração é molhar ou secagem.
7. Para amostras de implante, cada uma das amostras e o tempo de implante corresponde a um único ciclo de testes cíclicos. Medir o módulo de Young, utilizando o procedimento descrito acima para cada uma das amostras do implante.
8. Traçar o módulo de Young do implante em função do tempo. Neste ponto, podem ser feitas comparações com as investigações de bancada, etc

Results

As propriedades mecânicas de quase todos os materiais poliméricos, incluindo o nosso PVAc-CN, estão dependentes da exposição a condições ambientais. Mais notavelmente, que incluem a exposição ao calor e à umidade. Quando um material é plastificado, devido à absorção de umidade, ou sofre uma transição térmica, apresenta uma redução no módulo de Young. Na preparação da humidade ambiente e temperatura controlada por ex vivo da amostra caracterização mecânica, é importante para assegurar que não há alteração mínima...

Discussion

O avanço dos sistemas microeletromecânicos biomédicos implantáveis ​​(bioMEMS) para interagir com os sistemas biológicos está motivando o desenvolvimento de novos materiais com propriedades altamente personalizadas. Alguns destes materiais são desenhados para apresentar uma mudança nas propriedades do material, em resposta a um estímulo encontrado no ambiente fisiológico. Uma classe, recentemente desenvolvida de materiais responde à presença de hidrogénio líquidos de formação de ligações (por exemplo, água) e a...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bolacha	de silício Universidade Wafer		Grau mecânico
Folha de acrílico extrudado	Plásticos profissionais	SACR 062EF	Espessura 0,062 "
Lâmina de barbear	McMaster-Carr	3962A3
Pinças	McMaster-Carr	8384A47	# 5 ponta
Super Cola Gel	Loctite	130380
Ar Escova	Snap-on Industrial	BF175TA
Compressor de Ar	Paasche	B002YKN8YO	D500
Termopar	Omega	HH12A
Placa quente	Cimarec	SP131325Q
CO2 laser de gravação direta	VersaLaser	3.5
Dessecador	Fisher Scientific	08-595
Lâmpada			testador
		de microtração	sob