Prosencéfalo gravação eletrofisiológico em larval Zebrafish

Resumo

Um método simples para gravar os potenciais de campo extracelulares no larval do peixe-zebra é descrita prosencéfalo. O método proporciona um forte In vivo Leitura de apreensão como atividade. Esta técnica pode ser utilizada com larvas do peixe geneticamente modificada carregando epilepsia genes relacionados ou convulsões evocadas pela administração de fármacos convulsivos.

Resumo

A epilepsia afeta cerca de 3 milhões de pessoas nos Estados Unidos e até 50 milhões de pessoas em todo o mundo. Definido como a ocorrência de convulsões espontâneas não provocados, a epilepsia pode ser adquirido como resultado de um insulto ao cérebro ou a uma mutação genética. Os esforços para convulsões modelo em animais têm utilizado principalmente adquiridos insultos (fármacos convulsivos, estimulação ou lesão cerebral) e manipulações genéticas (knockdown antisense, a recombinação homóloga ou transgénese) em roedores. Zebrafish é um sistema modelo de vertebrados ^1-3 que poderia fornecer uma alternativa valiosa para roedor pesquisa baseada em epilepsia. Peixe-zebra são amplamente utilizados no estudo da genética de vertebrados ou de desenvolvimento, exibem um elevado grau de semelhança genética para os mamíferos e expressam homólogos de ~ 85% de humanos conhecidos mutações de um único gene de epilepsia. Devido ao seu tamanho pequeno (4-6 mm de comprimento), larvas de peixe-zebra pode ser mantida em volumes de fluidos tão baixo como 100 ul durante o desenvolvimento inicial e arraYED em multi-poços. Os reagentes podem ser adicionados directamente à solução em que os embriões se desenvolvem, o que simplifica a administração do fármaco e permitindo uma rápida no rastreio in vivo de compostos de teste ^4. Os oligonucleótidos sintéticos (morpholinos), mutagénese, dedo de zinco nuclease e abordagens transgénicas podem ser utilizadas para gerar rapidamente knockdown gene ou mutação no peixe-zebra ^5-7. Estas propriedades pagar estudos zebrafish uma vantagem sem precedentes análise estatística poder sobre roedores para o estudo de distúrbios neurológicos como a epilepsia. Porque o "padrão ouro" para a pesquisa a epilepsia é monitorar e analisar as descargas elétricas anormais que se originam em uma estrutura cerebral central (isto é, convulsões), um método eficiente para registrar a atividade cerebral em larvas do peixe-zebra é descrito aqui. Este método é uma adaptação de técnicas convencionais de gravação extracelular e permite a monitorização a longo prazo estável de actividade do cérebro em larvas do peixe intacta. Sgravações amplas são mostrados para convulsões agudas induzidas pela aplicação de banho de drogas convulsivas e apreensões espontâneas gravadas em um peixe geneticamente modificado.

Protocolo

1. Produção de ovos e Cobrança

1. Zebrafish criação segue procedimento padrão descrito anteriormente ^8. Resumidamente, zebrafish adultos são criados em tanques de criação com divisórias no lugar. Quando as luzes da sala de vir na manhã seguinte, divisórias são removidas de reprodução tanques e os peixes são permitidos aproximadamente 20 a 60 minutos de tempo de acasalamento imperturbável.
2. Ovos de tanques de criação são coletados em uma peneira e lavadas com água de ovo. Os ovos são então transferidos para uma placa de Petri com água de ovo. Ovos não fertilizados e detritos são removidos utilizando uma pipeta de transferência.
3. Pr....

Resultados

Exemplos de descarga do tipo convulsivas electrográfico gravado no cérebro anterior de um agar-embedded larvas do peixe são mostrados na Figura 1. De grande amplitude de descarga explosão multi-pico nas amostras foi evocado por aplicação de banho de um fármaco convulsivo, 40 mM de pilocarpina (em A, 6 dpf) ou 1 mM de picrotoxina (em B, 8 dpf). Nestes registos, imobilizado e de ágar-embedded zebrafish são monitorados continuamente durante até 90 min. Peixe permanecem viáveis ​​nestas condições de gravaçã.......

Discussão

O método de gravação extracelular aqui apresentada permite uma análise muito sensível e rápido de atividade cerebral. Estas gravações são análogos a monitorização (EEG) eletroencefalográficos vulgarmente usado para avaliar a presença de descarga eléctrica anormal (isto é, convulsões) em modelos de roedores de epilepsia e ¹¹ pacientes ^12. Gravações extracelulares podem ser combinadas com as manipulações farmacológicas, como mostrado aqui. Estes tipos de gravações podem também ser usados ​​p.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
Agarose de fusão baixo	Fisher-Científico	BP1360-100	Dissolver em mídia de embrião em 1,2%
Mídia de gravação	Fisher-Científico	BP3581, P330-3, BP410-1, BP214-500, D16-1, C77-500	1 mM de NaCl, 2,9 mM KCl, 10 mM de HEPES, 1,2 mM de MgCl2, 10 mM de dextrose, 2,1 mM CaCl 2 o pH para aproximadamente 7,3 com NaOH 1 N
Tricaina	Argent Labs	MS-222	0,02%
α-bungarotoxina	Tocris Bioscience	2133	1 mg / ml
Um tubo de vidro capilar	Warner Instruments	G120TF-3	Puxar a uma resistência de 2 -7 MQ
Amplificador de fixação de membranas	Warner Instruments	PC-505B	Nós usamos um amplificador Warner no modo de fixação de corrente; Ganho fixado em 2 mV / PA e filtro de Bessel fixado em 2K. Modelos comparáveis ​​podem ser usados ​​de acordo com as instruções do fabricante.
Filtro amplificador /	Cygnus Tecnologia	FLA-01	Nós usamos um Cygnus pré-amplificador; Ganho fixado em 10-20; Frequência de corte fixada em 1-2K; filtro Notch IN. Modelos comparáveis ​​podem ser usados ​​de acordo com as instruções do fabricante.
Axon A / D bordo e software Axoscope	Molecular Devices	Axon Digidata 1320A; Axoscope 8,2	Os dados são coletados em Axoscope usando lacuna livre modo de aquisição; amostragem de 10 kHz. Modelos comparáveis ​​e os programas podem ser usados ​​de acordo com as instruções do fabricante.
Água ovo	Instant Oceano		3 g Instantânea Oceano mar de sal, 2 ml de azul de metileno 0,1% em 10 ml de água deionizada