Artigo de método

Drosophila Adulto Olfativo Choque Aprendizagem

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DOI:

10.3791/50107

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7 de agosto de 2014

 , 
1Physiology and Pharmacology, University of Bristol

Neste artigo

Resumo

O método para medir adulto Drosophila memória associativa é descrito. O ensaio é baseado na capacidade de tempo real para associar um odor apresentado com um reforçador negativa (choque eléctrico) e depois recupera esta informação numa altura posterior, permitindo que a memória a ser medido.

Resumo

Drosophila têm sido utilizados em experiências de condicionamento clássicos para mais de 40 anos, assim, facilitando grandemente a nossa compreensão da memória, incluindo a elucidação dos mecanismos moleculares envolvidos em doenças cognitivas 1-7. Aprendizagem e memória pode ser testada em larvas de estudar o efeito de genes do desenvolvimento neurológico 8-10 e nas moscas para medir a contribuição de genes plasticidade adultos 1-7. Além disso, o curto tempo de vida da Drosophila facilita a análise de genes medeiam relacionada com a idade perda de memória 5,11-13. A disponibilidade de vários promotores indutiveis que subdividem o sistema nervoso Drosophila torna possível determinar quando e onde um gene de interesse é necessária para a memória normal, bem como relé de diferentes aspectos do sinal de reforço 3,4,14,16.

Memória Estudar no adulto Drosophila permite uma análise detalhada docomportamento e circuitos envolvidos e uma medida da memória de longa duração 15 -17. A duração da fase adulta acomoda manipulações genéticas, comportamentais, alimentares e farmacológicos de longo prazo de memória, para além de determinar o efeito do envelhecimento e das doenças neurodegenerativas em memória 3-6,11-13,15-21.

O condicionamento clássico é induzida pela apresentação simultânea de um sinal de odor neutro (estímulo condicionado, CS +) e um estímulo de reforço, por exemplo., Um choque eléctrico ou de sacarose, (estímulo não condicionado, EUA), que passam a ser associados um com o outro pelo animal 1,16. Um estímulo segunda condicionado (CS -) é posteriormente apresentado sem os EUA. Durante a fase de testes, Drosophila são simultaneamente apresentados com CS + e odores CS. Após o tempo de Drosophila são fornecidos para escolher entre os odores, a distribuição dos animais é gravado. Esta al procedimentobaixos associativas condicionamento aversivo ou apetitivo a ser mensurado de forma confiável sem um viés introduzido pela preferência inata por um dos estímulos condicionados. Várias experiências de controlo são também realizadas para testar se todos os genótipos de responder normalmente a odor e de reforço sozinha.

Introdução

O método aqui apresentado é o descrito por Tully e Quinn com algumas pequenas modificações 1. A experiência é realizada em duas fases: as moscas são formados na primeira fase, e que as moscas são treinados testados na segunda fase. Durante o treinamento, um grupo de moscas são simultaneamente expostos a um odor (CS +) e um choque elétrico (US) em um tubo de treinamento. As moscas, então, receber odor 2 (CS -) sem um choque elétrico. Este único emparelhamento de um odor especial com o choque é chamado de treinamento de 1 ciclo, e os odores que são mais frequentemente utilizados são de 4 metilciclohexanol (MCH) e 3-octanol (OCT).

A formação de um ciclo, conduz à formação de uma fase lábil de memória que pode ser detectado por até 7 horas; no entanto, a memória é normalmente testado imediatamente para determinar o que é chamado de aprendizagem, aquisição ou 2 min de memória. Memória medida a 30 min ou 1 hora é conhecido como a memória de curto prazo, enquanto3 hr memória é referido como a memória intermédia. A exposição de moscas para ciclos de treinamento repetitivos com intervalos entre os ciclos de formação (formação espaçada) leva a uma forma consolidada de memória de longo prazo, que é dependente de transcrição CREB e dura até uma semana. Formação sem lacunas (treino concentrado) conduz à formação de memória anestesia-resistente (MRA), que semelhante ao da memória de longa duração, é tipicamente medida 24 horas após 5 ciclos de formação 7,13,15-17,20,21.

Com esta abordagem, o efeito de várias mutações do gene sobre estas diferentes fases de memória pode ser determinada. A expressão-driven promotor de transgenes-luz ou sensíveis à temperatura para ativar ou bloquear a atividade neural de neurônios específicos permite investigar quais neurônios são necessários para a aquisição de memória, consolidação e recuperação 3,4,11,15,16,20, 22-24. Memória em 1 hora é normalmente medido quando se estuda perda de memória relacionada com a idade, porque este fORM de memória parece ser particularmente vulneráveis ​​aos efeitos do envelhecimento 11-13. A gama completa dos controlos comportamentais e genéticos são realizados com experiências de memória, por exemplo, para determinar se um defeito do desempenho é devido a um defeito de memória central ou de um defeito sensorial periférica que impede a mosca de detecção do choque ou sugestão olfactiva 5 -7, 1 7, 25,26.

Protocolo

1. Fly Preparação

  1. Outcross todos os mutantes, Gal4 / UEA e outras linhas com uma cepa do tipo selvagem, como CSw-, por pelo menos seis gerações antes dos experimentos comportamentais para controlar para o fundo genético 26.
  2. Cresça sobre moscas uma farinha de milho, levedura e melaço dieta padrão sob um ciclo de luz-escuro de 12:12 hr a 25 ° C, a menos manipulações específicas requerem uma temperatura diferente.
    1. Para determinar os efeitos da expressão do transgene: Utilização de 18 ° C para evitar a expressão de transgenes em Gal4 Gal80 ts (sistema alvo) por meio do desenvolvimento e, em seguida, mover as moscas a uma incubadora a 30 ° C de 1-2 dias antes da experiência comportamental. Realizar o ensaio a 30 ° C para determinar o efeito da expressão do transgene 3,4,6,7,14.
    2. Para as experiências que utilizam canais de TRPA1 activado por calor para estimular os neurónios: Levante as moscas a 23 ° C, que é uma temperatura conhecidapara manter um canal inactivo, e então mudar para uma sala de comportamento, a 30 ° C para activar o TRPA1 expressando neurónios.
    3. Para experimentos com temperatura Shibire sensível para bloquear a saída sináptica 11, 14,24: Rear as moscas a 18 ° C e realizar testes a 30 ° C.
  3. Recolha as moscas 1-2 dias antes do experimento e contá-los em grupos de cerca de 25 sob a luz de CO 2 anestesia. Armazenar as moscas, pelo menos, S / N, em frascos de comida (sem levedura) a 25 ° C (a menos que as manipulações específicas necessária uma temperatura diferente) e uma humidade de 70% em relação a um ambiente controlado, com luz 0:12 horas: condições de escuridão até à hora da experiência.
    Nota: Este armazenamento permite que as moscas para se acostumar com o teste de aprendizagem subseqüente realizada na sala de ambiente controlado, que tinha as condições ideais para Drosophila aprendizagem e, sobretudo, remove qualquer envi diáriavariações am- que podem ter afetado o fenótipo comportamental.

2 Preparação antes do experimento

  1. Execute as experiências em um perspex T-labirinto feito por encomenda (Figura 1).
  2. Verifique regularmente o tubo de montagem para garantir que uma vedação hermética é obtido durante o experimento. Se necessário, altere os anéis de vedação que vedam os compartimentos dentro do T-maze.
  3. Coloque grades de cobre feitos por dentro dos tubos de treinamento. Verifique e limpe regularmente essas grades, e substitua se oxidado. Prenda as grades de cobre para cabos via clipes de crocodilo que correm para uma caixa de interruptor conectado a um estimulador elétrico. Usar um voltímetro para assegurar que o aparelho está a fornecer o choque necessária.
  4. Utilize G-braçadeiras para segurar o labirinto firmemente para evitar qualquer fuga de ar.
  5. Anexar labirinto em T para tubagens que corre a uma bomba de ar, para permitir que os odores para ser traçada entre as moscas e subsequentemente removido do labirinto-T. Manter ar suavefluir em ~ 2 L / min

3. Odor diluições

  1. Usar dois odores diferentes em concentrações tais que as moscas apresentam uma preferência igual para ambos os odores. Use 4-metilciclo-hexanol (1:67) e 3-octanol (1: 100) diluída em óleo mineral 7,13.
    Nota: Determine cuidadosamente estas concentrações, que variam de laboratório. Por exemplo, outros usam 1:10 para ambos os odores 24. Outros odores comumente utilizados incluem acetato de etilo e acetato de iso-amilo.
  2. Pipetar 30 ul de odor diluído em um copo de odores feito por encomenda colocada num bloco de odor coberto por um tubo de plástico com uma parte superior perfurada que permite que o ar seja arrastado através do odor no copo, expondo assim as moscas a uma pluma de odor.

4. protocolo de treinamento (Figuras 1 e 2)

  1. Para o adulto choque condicionado olfativo, realizar todos os experimentos sob uma fraca luz vermelha (ou seja., LED vermelho), o que permite ao pesquisador a ver, mas impede que o fly de vista, permitindo assim que as moscas se concentrar no olfacto, por oposição às entradas visuais.
  2. Apresente as moscas dentro do tubo de formação e, em seguida, anexar ao T-maze e permitir-lhes adaptar-se ao tubo e fluxo de ar por 90 segundos.
  3. Apresentar o primeiro odor (4-metilciclohexanol, MCH) com um choque de 60-V (que consiste de doze pulsos 1,25 segundos com intervalos inter-pulso 3,75 seg) para uma duração total de 60 segundos.
  4. Siga o choque com um período de descanso de 30 segundos sem odor ou choque.
  5. Apresentar o segundo odor (3-octanol, OCT) para 60 segundos sem um choque.
  6. Siga o choque com um período de descanso de 30 segundos sem odor ou choque.
  7. Mover as moscas da câmara de formação no interior da câmara central do labirinto em T, rodando o labirinto em T de lado e batendo suavemente a parte inferior do labirinto em T com uma superfície macia, tal como um tapete de rato velho. Manter as moscas na câmara central para 90 seg.
  8. Coloque os tubos de escolha para o bottom do aparelho para formar o labirinto-T.
  9. Para medir a aprendizagem, mover as moscas para o ponto de escolha do labirinto em T, onde foram expostas simultaneamente a ambos os odores e avançar para um. Realizar um período de teste, durante 120 segundos.
  10. Armadilha as moscas nos tubos de escolha, deslizando a câmara central-se, assim, bloquear as extremidades dos tubos de escolha. Recolher as moscas em cada braço do labirinto em T e no compartimento central em frascos de contagem e de alimentos.
  11. Para medir a memória, coletar as moscas após o treinamento (4.6) e transferi-los a partir do T-maze para frascos de alimentos sem fermento. Loja opera no escuro a 25 ° C e 70% de humidade durante o restante tempo necessário para determinar a fase de memória de interesse (ver introdução). Reintroduzir as moscas para o labirinto em T como na etapa 4.7.
  12. Para a memória de longo prazo, use um labirinto construído sob encomenda que permite que vários lotes de moscas para ser treinado em simultâneo. Administrar 5 ciclos de formação, com 15 min de intervalo inter-ciclo (spaced) ou sem um intervalo inter-ciclo (amontoados). Manter as moscas a 18 ° C e umidade de 70% no escuro até que o teste. Antes do teste, mover as moscas a 25 ° C, permitindo-lhes a aclimatar durante pelo menos 1 hr. Avaliar a memória de longo prazo de 24 horas após o treino.
  13. Após os experimentos comportamentais, limpar os copos de odor com água quente e detergente sem cheiro. Após a secagem, revestimento das cápsulas com 10 mL Sigmacote. Seca-se a Sigmacote por aquecimento em um forno de microondas. Ocasionalmente, limpe a tubos de plexiglas e blocos de odor T-labirinto com água quente e detergente sem cheiro.

5 Cálculo do Índice de Desempenho: a Medida da Memória das Moscas

  1. Calcule o Índice de Desempenho (PI) para cada condição de que o número de moscas, evitando o odor emparelhado-choque (CS -) menos o número de moscas que escolhem o odor emparelhado-choque (CS +) dividido pelo número total de moscas (CS - + CS +) 1.
    PeÍndice rformance (PI) = (# CS - voa - # CS + voa) / (# Total de moscas)
  2. Calcule o PI final do experimento, a média do PI do experimento em que MCH foi o odor emparelhado-choque e um em que outubro foi o odor emparelhado-choque. Isso elimina qualquer tendência das moscas que têm uma preferência maior por um odor.

6. Controles sensório-motor

  1. Realizar odor acuidade através da introdução de ~ 40-50 moscas em labirinto em T 6,7,17.
  2. Depois de 90 segundos, mova as moscas para o ponto de escolha, e permitir-lhes dois minutos para escolher entre odores puros e ar.
  3. Coletar e contar as moscas. Calcule a porcentagem evitar dividindo o número total de moscas que escolheram o odor por aqueles que participaram do teste.
  4. Para choque reatividade 6,7,17, introduzir as moscas na câmara de choque.
  5. Depois de 90 segundos de repouso, administra um choque eléctrico de 60 V DC, a partir do qual as moscas podem escapar para um semelhantetubo sem um choque.
  6. Permitir 2 min para as moscas para escolher; recolher e contar as moscas. Calcula-se a percentagem de evasão de choque através da divisão do número de moscas que evitaram o choque por escapar do tubo de choque através do número total de moscas no experimento. Incluir as moscas que permanecem na câmara central no total de pessoas que escaparam do choque elétrico.

Resultados

O índice de desempenho (PI) serve como uma medida da memória. A Tabela 1 ilustra um cálculo representativo de PI.

MCH associado a um choque 3-OCT associado a um choque
Moscas evitando MCH (em tubo de outubro) = 80
Moscas preferindo MCH (em tubo MCH) = 20
PI 1 - (80-20) / 80 + 20)
= 0,6 		Moscas evitando outubro (em tubo MCH) = 75
Moscas preferindo outubro (em tubo de outubro) = 25
PI 2 = (75-25) / (75 + 25)
= 0,5
PI do experimento = (0,6 + 0,5) /2=0.55

Tabela 1 Um representante de cálculo do índice de desempenho utilizando os dados ilustrativos. Índices de desempenho para experiências diferentes podem ser comparados para elucidar os efeitos de memória. Uma vez que talde comparação é mostrado na Figura 3, que contém os resultados de uma série de experiências realizadas com Canton S moscas de tipo selvagem (WT) adulto e adulto burro aprendizagem mutante voa 1. A média de 10 IPs é fornecido, com barras de erro representam o erro padrão da média (SEM). Estes resultados demonstram que as moscas burro mostram uma redução na aprendizagem em comparação com o tipo selvagem.

figure-results-1
Figura 1 O adulto experimental set-up. As moscas são treinados e testados em um labirinto T. A formação envolve a apresentação de um odor com um choque eléctrico, seguido por um segundo, sem odor B choque eléctrico. Após um período de repouso na câmara intermediária que as moscas são apresentados com ambos os odores simultaneamente. As moscas são presosnos dois tubos e recolhido e contado para obter pontuação de aprendizagem / memória.

figure-results-2
Figura 2 O protocolo de formação de adultos. As moscas estão treinando em dois passos. A primeira etapa onde as moscas receber um odor (CS +) emparelhado com choque elétrico (US) por 60 seg. Na próxima etapa, as moscas recebem uma segunda odor (CS), sem choques eléctricos. As moscas são, em seguida, deixado em repouso durante 90 segundos, após os quais foram testados para a sua escolha entre CS + e CS.

figure-results-3
Figura 3 Um gráfico representativo mostrando burro e aprendizagem wildtype em adultos Drosophila. WT e moscas burro foram testados após uma sessão de treinamento. Burro moscas mostram uma redução na aprendizagem em comparação com o WT (n = 10).

Discussão

O ensaio de aprendizagem olfactiva choque Drosophila adulta aqui apresentada permite a análise dos mecanismos moleculares subjacentes diferentes fases de memória, incluindo a memória de longo prazo 15-17. Bem como a determinação do efeito do ritmo circadiano do sono, 18, ​​19, 20,21 dieta senescência 11-13, doença neurodegenerativa 5 e tratamentos com medicamentos 5,6,19 na memória.

Muitas abordagens poderosas foram recentemente desenvolvidos para a imagem funcional dos circuitos neurais que mediam a memória olfativa em moscas 3,4,7,11,16,27. Estas técnicas optogenetic utilizar o vasto repertório de diferentes promotores de Drosophila disponíveis em 14,16. Estes promotores são usados ​​para expressar cálcio e Camp repórteres geneticamente codificados nos neurônios da memória 16,27 para estudar o efeito de mutações genéticas específicas em traços de memória.

The utilização de promotores e mutações em adultos condicionais permite o estudo do papel ao nível pós-desenvolvimento de um produto do gene na memória 3,4,6,7,13,14. Imagem e abordagens comportamentais podem ser combinados com os canais leves e activado por calor para estimular ou inibir a diferentes neurónios, no circuito de memória 11,14,16,22-24 para elucidar ainda mais a sua função. Além disso, os neurônios da memória do corpo cogumelo são acessíveis a célula inteira gravações patch clamp 28 e técnicas matemáticas e computacionais estão sendo usados ​​para modelar Drosophila memória olfativa 29.

Esses avanços experimentais, combinadas com as diferentes formas de protocolos de memória associativa introduzidas aqui, permitir Drosophila a ser usado para modelar os molecular-e no nível do circuito alterações na memória associativa que ocorrem em resposta à recompensa, punição, a motivação, o vício, o envelhecimento ea doença 5,6,11-13,16,30-31.

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Reconhecemos centros banco de Bloomington para a tensão mosca. Este trabalho foi financiado pela bolsa de pesquisa da BBSRC (BB / G008973 / 1).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
3-OctanolSigma218405
4-Metil ciclohexanolSigma15309-5
BenzaldeídoSigma418099
Óleo mineralFlukaBP2629-1
Acetato de hexilaSigma108154
frutoseSigmaF0127
AgaroseBiolinhaBIO-41025

Referências

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