Um modelo de contusão grave lesão da medula espinhal é descrito. As etapas detalhadas no pré-operatório, operatório e pós-operatório são descritos para obter um modelo consistente.
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Artigo de método
Um modelo de contusão grave de lesão medular em ratos
Neste artigo
Resumo
Resumo
O potencial translacional de novos tratamentos devem ser investigadas em lesão medular grave (SCI) modelos de contusão. A metodologia detalhada é descrita a obtenção de um modelo consistente de SCI grave. Utilização de uma moldura estereotáxica e computador pêndulo controlada permite a criação de lesão reprodutível. Hipotermia e infecção do trato urinário representam desafios significativos no período pós-operatório. Monitorização cuidadosa dos animais com registro de peso diário e expressão bexiga permite a detecção precoce de complicações pós-operatórias. Os resultados funcionais deste modelo de contusão são equivalentes aos modelos transecção. O modelo de contusão pode ser utilizado para avaliar a eficácia de ambas as abordagens neuroprotectores e neuroregenerative.
Introdução
Escolha do modelo de lesão adequado é fundamental para a avaliação pré-clínica de novos tratamentos para a lesão da medula espinhal (SCI). 1,2,13 Em uma recente pesquisa de médicos e cientistas no domínio do modelo de contusão neurotrauma, ao contrário de hemisection ou modelos completos transecção , foi universalmente aceito para ser clinicamente relevante. 8 Esta opinião é baseada na observação de que a maioria da lesão medular em humanos é contundente na natureza. 10 A biologia de contusão também parece ser diferente dos modelos hemissecção ou transecção. Iseda 11, et ai. comparou o efeito de injecção intra-espinal condroitinase ABC no neuroregeneração separadamente em contusão hemisecção e modelos. quatro regeneração axonal foi observada na ponte neuronal em hemisecção mas não o grupo SCI contusão. O hemisection ou modelos completos transecção também criar condições conhecidas de existir em apenas um pequeno subconjunto de clcircunstâncias inical. Por exemplo, vários investigadores têm utilizado as intervenções baseadas em andaime para o implante na cavidade lesão após hemisection ou transecção completa para promover a regeneração. 6 Essa abordagem torna-se clinicamente irrelevante, porque a criação de uma cavidade dentro lesionado medular é impraticável e provavelmente antiético.
Variabilidade na recuperação funcional continua a ser um grande desafio para os modelos de contusão. 5,12 Esta variabilidade pode ser minimizado pela utilização de pêndulo, controlado por computador e estabilização da coluna vertebral antes do impacto, para a entrega de força uniforme, através do volume da medula espinal nomeadamente as vias motoras ventralmente localizadas . Deve-se notar que a plasticidade ea contribuição garantia de sobreviventes axônios é o mecanismo predominante de recuperação após a lesão medular. 1 Portanto, mesmo pequenas variações na técnica de contusão pode produzir resultados significativamente diferentes. Para este fim, temos desenvolvidoum modelo de grave lesão da medula espinhal que produz volume de contusão consistente e recuperação funcional comparável com modelos transecção. Este modelo pode ser utilizado para investigar tanto a neuroproteção e estratégias neuroregeneração como uma prova de conceito para a eficácia do tratamento.
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Protocolo
1. Preparação Antes de Lesão Medular
Os instrumentos cirúrgicos necessários para este procedimento são bisturi, captadores com e sem dentes, hemostats, afastadores de auto-retenção, rongeurs de ponta fina, motorista agulha, suturas absorvíveis e clip aplicadores da pele. Outros suprimentos cirúrgicos necessários são campos cirúrgicos, lençóis estéreis para campo operatório, gaze esponjas, aplicadores de algodão-ponta, e folhas metálicas. Autoclave os instrumentos cirúrgicos e material antes da cirurgia. Use o conjunto individual de instrumentos e materiais para um animal. Limpe a área cirúrgica e aparelhos (pêndulo, fonte de luz, quadro estereotáxico, contas de vidro esterilizadores, e esquentadores), com algodão embebido em álcool.
Abra as cortinas cirúrgicas e usar luvas estéreis para armar o campo cirúrgico cuidadosamente evitando a contaminação. Abra os instrumentos individuais esterilizada e coloque cuidadosamente as do campo cirúrgico. Cubra os botões e puxadores de thaparelhos e provavelmente necessário durante o procedimento, com a folha metálica estéril. Ligar o talão esterilizador de vidro para estar pronto para o uso durante o procedimento.
2. Preparação dos Animais
Trazer os ratos para o laboratório algumas horas antes da área do procedimento real. Administrar medicação para a dor, pelo menos, uma hora antes do procedimento esperado (tipicamente buprinorphine 1,5 ml de 0,006 mg / ml por via subcutânea). Administrar antibióticos pré-operatórios (Baytril tipicamente de 4 mg / kg por via subcutânea). Anestesiar os ratos utilizando 90 mg / kg de cetamina e esperar até que não haja resposta toe-pitada. Palpar o processo espinhoso mais proeminente na coluna torácica. Este nível corresponde tipicamente com T10 processo espinhoso. Marque a localização do nível pretendido em relação a T10. Em nosso laboratório realizamos uma lesão T10. A narrativa seguinte descreve a técnica de T10 SCI. Shave a 3 centímetros x 6 cm rectângulo longitudinalmente e centrado em T10 nível. Limpe a pele três vezes wisolução Betadine ª. Aplique lubrificante oftálmico em cada olho. Transfira o rato em uma posição confortável para o campo cirúrgico cuidadosamente evitando a contaminação. Insira uma sonda rectal de temperatura para monitorizar a temperatura do núcleo e ajustar o aquecimento em conformidade para manter a temperatura do animal mais próximo do normal (~ 37,5 ° C), como possível. Cobrir o rato com uma cobertura cirúrgica com uma janela sobre o local cirúrgico.
3. Procedimento Cirúrgico
Comece com uma incisão de aproximadamente 4 centímetros usando uma lâmina # 10 centrada na marca T10. Proceder de dissecar pacientemente fáscia e camadas musculares longe das T9-T11 processos espinhosos e lâminas. Coloque afastadores para retrair o músculo e fáscia longe do osso. Enquanto a estabilização do processo espinhoso de T9 acentuadamente dividir o ligamento interespinhoso entre T9 e T10 usando uma tesoura fina. Da mesma forma a estabilizar o processo espinhoso T10 e dividir o ligamento interespinhoso entre T10-T11. Use ampliação loop para complete a divisão dos ligamentos todo o caminho através do ligamento amarelo (Figura 1). O saco tecal é facilmente perceptível uma vez que o ligamento amarelo é desconectada. Use fórceps de ponta fina para realizar cuidadosamente peça-refeição laminectomia bilateral em T10. O máximo de cuidado é tomado para evitar a pressão sobre o saco tecal e ferimento acidental com as pontas rongeur. A lâmina e processo espinhoso de T10 é completamente removido.
Coloque o animal em posição na plataforma de estabilização. Use grampos estabilizantes para imobilizar a coluna por aperto as faces laterais do corpo vertebral T11 seguido pelas faces laterais do corpo vertebral T9. Tenha cuidado para não comprimir o rato na plataforma com os grampos de estabilização, pois isso seria restringir o espaço para os movimentos respiratórios e adicione estresse indesejado do animal. Depois de garantir os ajustes da coluna vertebral no pêndulo controlado por computador são verificados. Normalmente usamos ponta pêndulo de 3,0 mm a uma speed de 4 cm / s, com uma profundidade de 2 mm e um tempo de permanência de 0,3 segundos. Estenda a ponta do pêndulo eo abaixá-lo até tocar a superfície do fio. Retrair a ponta e diminuir o dispositivo de 2 milímetros em direção à superfície da medula espinhal. Solte pistão a 4 cm / seg para causar grave contusão lesão medular. Atingir hemostasia utilizando apenas pressão suficiente para manter o aplicador com ponta de algodão no lugar, tomando cuidado para não criar qualquer pressão desnecessária sobre o cabo. Sutura muscular e camadas de fáscia com uma figura-8 ponto tomando cuidado para não puxar o muito apertado com suturas absorvíveis. Fechar a pele com um mínimo de dois pequenos grampos, até 4 ou 5 grampos podem ser utilizados, se as partes da incisão permanecer aberto após os primeiros dois ou três grampos.
3. Cuidados pós-procedimento
Ratos num ambiente quente de cerca de 33-35 ° C por 24 horas pós-cirurgia. Isto implica uma incubadora (enquanto eles são inconscientes) e um espaço gaiola aquecida, uma vez que eles começam a se mover. Uma vez que os ratos são totalmente awake, administrar 5 ml de soro fisiológico, 1,5 ml (0,006 mg / ml) de buprinorphine, e 0,1 ml de Baytril todos subcutaneamente. Continue com buprinorphine por via subcutânea duas vezes por dia para o primeiro 24-48 hr e Baytril uma vez por dia durante 7 dias. As bexigas deve ser ordenhado, três vezes por dia até o retorno da função de bexiga (<2 ml de urina na expressão de manhã cedo, durante 3 dias consecutivos). Os animais também deve ser verificado durante este tempo de infecção (sangue na urina, cor esbranquiçada, ou um odor desagradável), diminuição da atividade física ou problemas de cicatrização. Presença de infecção deve ser combatida com o aumento da dose (ou reinício) de antibióticos em consulta com veterinários locais. Pesar ratos diariamente a partir do dia após a cirurgia para avaliar a sua recuperação.
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Resultados
Volume lesão
Obtivemos grandes volumes de lesão e consistente, seguindo a técnica acima descrita. Usando um Luxol rápida coloração de uma volume de lesão média de 2,04 mm 3 (IC 1,9-2,18 95%) (n = 5 animais) foi obtido azul. Figura 2 mostra a média do volume da lesão com uma coloração representativo usando Luxol azul rápido através do epicentro da lesão.
Escores funcionais
As pontuações de comportamento medidos pe...
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Discussão
Vários novos tratamentos têm mostrado recentemente promessa adiantada no campo de pesquisa SCI. 3 avaliação cuidadosa destes tratamentos é essencial no modelo clinicamente relevante da SCI para selecionar estratégias com potencial translacional máximo. Um esquema de classificação foi recentemente desenvolvido para avaliar a força de estudos pré-clínicos. 9 Este esquema enfatizou a importância da utilização do modelo de SCI contusão grave. Aqui nós descrevemos um modelo desse tipo de contusão SCI gr...
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Divulgações
Nenhum divulgação financeira
Nenhum divulgação financiamento.
Agradecimentos
Os autores agradecem ao Dr. N. Banik e Dr. D. Mitchell para a sua orientação no desenvolvimento deste modelo.
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Materiais
Instrumentos cirúrgicos
Infinite Horizons (anteriormente OSU) <td colspan="4">Scissors Fine Science Tools Inc 14094-11 ou 14060-09 Fórceps Fine Science Tools Inc 11006-12 e 11027-12 ou 11506-12 Hemostats Fine Science Tools Inc TSE
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Impactor controlado por computador | Leica ou o impactor | ||
| 13009-12 | |||
| Retractors | Fine Science Tools Inc | 17011-10 | |
| Rongeurs | Fine Science Tools Inc | 16020-14 | |
| Chave de agulha | Fine Science Tools Inc | 12001-13 | |
| Quadro estereotáxico | Leica ou RWD Life Science Co. ou sistemas | ||
| Buprinorfina | |||
| Baytril | Bayer | ||
| Cetamina |
Referências
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Reimpressões e permissões
