Isolamento, coleta e Enriquecimento de bactérias naturais magnetotáticas do Meio Ambiente

Zachery Oestreicher; Steven K. Lower; Wei Lin; Brian H. Lower

doi:10.3791/50123

Artigo de método

Isolamento, coleta e Enriquecimento de bactérias naturais magnetotáticas do Meio Ambiente

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DOI:

10.3791/50123

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15 de novembro de 2012

Zachery Oestreicher¹ , Steven K. Lower¹^,² , Wei Lin³ , Brian H. Lower²

¹School of Earth Sciences, The Ohio State University, ²School of Environment & Natural Resources, The Ohio State University, ³Institute of Geology and Geophysics, Chinese Academy of Sciences

Neste artigo

Resumo

Nós demonstramos um método para recolher bactérias magnetotáticas (MTB), que podem ser aplicadas para águas naturais. MTB podem ser isolados e enriquecidos a partir de amostras de sedimento utilizando uma configuração relativamente simples que aproveita magnetismo da bactéria natural. Isolado MTB pode então ser analisada em detalhe utilizando luz e microscopia eletrônica.

Resumo

Bactérias magnetotáticas (MTB) são microorganismos aquáticos que foram pela primeira vez descritos nomeadamente em 1975 ^uma das amostras de sedimentos coletados em salinas de Massachusetts (EUA). Desde então MTB foram descobertos em água e sedimentos estratificados-colunas de todo o mundo ^2. Uma característica comum a todos MTB é que eles contêm magnetossomos, que são intracelulares, nanocristais ligado à membrana magnéticas de magnetita (Fe ₃ O ₄₎ e / ou greigite (Fe ₃ S ₄₎ ou ambos os ^{3, 4.} No hemisfério norte, MTB normalmente são atraídos para a extremidade sul de um ímã de barra, enquanto no hemisfério sul geralmente são atraídos para a extremidade norte de um ímã de ^3,5. Esta propriedade pode ser explorada durante a tentativa de isolar a partir de amostras ambientais MTB.

Uma das formas mais comuns de enriquecer MTB é a utilização de um contentor de plástico transparente de recolher os sedimentos e água a partir de uma fonte natural,tal como um tanque de água doce. No hemisfério norte, o sul de uma barra magnética é colocada contra a parte exterior do recipiente um pouco acima do sedimento na interface sedimento-água. Depois de algum tempo, a bactéria pode ser removido do interior do recipiente perto do magneto com uma pipeta e, em seguida, enriquecido ainda mais por meio de um capilar de pista ⁶ e um magnete. Uma vez enriquecido, a bactéria pode ser colocado sobre uma lamela de microscópio, utilizando um método de gota pendente e observados num microscópio de luz, ou depositado sobre uma grelha de cobre e observadas por microscopia electrónica de transmissão (TEM).

Usando este método, isolado MTB pode ser estudada microscopicamente para determinar características tais como o tipo de comportamento de natação, e número de flagelos a morfologia das células, das células, a forma dos cristais magnéticos, número de magnetossomos, o número de cadeias de magnetossomos em cada célula, a composição de os cristais nanomineral e presença de vacúolos intracelulares.

Protocolo

1. MTB Colecção

Ao decidir sobre um local de água doce para coletar bactérias magnetotáticas (MTB), muitas vezes é melhor começar com uma lagoa ou de baixa movimentação de fluxo que tem uma camada de sedimento suave lamacenta. Nesta demonstração coletamos uma amostra na margem do rio Olentangy no campus da Universidade Estadual de Ohio (OSU), em Columbus, Ohio (EUA). Embora isso fosse um local conveniente para a demonstração, o protocolo aqui descrito é aplicável a qualquer localização aquática. Os materiais utilizados no presente protocolo podem ser encontrados na Tabela 1. Encontrar um local onde a profundidade da água está entre 10 e 100 cm. Em um local tão, você deve coletar a camada superior mais de sedimentos usando uma clara, recipiente com tampa. Colher o sedimento e de água para dentro do recipiente até que é preenchido com um terço até metade do sedimento e o volume restante com água. Manter o recipiente submersa até ser enchido com água e, em seguida, firmemente tampar o recipiente wom a sua tampa de rosca de topo. Não é necessário misturar o sedimento. Limpe a parte externa do recipiente com uma toalha seca e depois tirar a amostra para o seu laboratório. Não é necessário apressar a amostra de volta para seu laboratório. Deixamos amostras de BTT em recipientes de plástico no campo por vários dias antes de trazê-los de volta para o nosso laboratório. O MTB deve ser viável por várias semanas a meses, desde que você armazenar as amostras em um local fresco e com sombra no campo.
Uma vez que a amostra está no seu laboratório, soltar a tampa e deixe que cobre o recipiente para reduzir a quantidade de evaporação. Armazenar o recipiente à temperatura ambiente num quarto escuro, gaveta, ou cobrir completamente o recipiente com uma folha de alumínio. Permitir que o sedimento e partículas finas de completamente assentar no fundo do recipiente, deixando a amostra em repouso durante várias horas a vários dias. Não é necessário misturar o sedimento, MTB prefere um ambiente sem ser perturbado. As paredes claras do recipiente de plásticopermitirá que você para confirmar que as partículas foram para o fundo. Dependendo da sua amostra, MTB podem permanecer vivos na amostra por muitos meses.

2. Isolamento MTB

Quando estiver pronto para isolar os ímanes MTB, local nos lados do recipiente de plástico a cerca de 1 cm acima da interface sedimento-água (Figura 1A). Ter cuidado para não perturbar o sedimento no fundo do recipiente. Coloque o pólo sul de uma barra magnética de um lado do recipiente e no lado norte de um outro íman em barra no lado oposto (Figura 1A). Quase todo o íman pode ser utilizado, tal como uma barra de agitação magnética ou ima grande. Tudo pode ser utilizado para suportar os ímans à altura correcta acima da interface água-sedimento. Descobrimos que os magnetos descansando sobre a parte superior de uma caixa de papelão ou de plástico é o melhor, no entanto, os ímans podem também ser gravados para o exterior do recipiente de plástico. Espere 30 minutos a várioshoras para as bactérias que nadar para o ímã.
Use uma pipeta estéril para recolher a água com cuidado de dentro do recipiente (Figura 1A), perto da posição do ímã de barra sul-pólos (para amostras coletadas no hemisfério Norte). Esta água deve conter o MTB que foram atraídos para o ímã de barra sul-pólo. Em seguida, uma pista de corrida capilar deve ser utilizada para enriquecer ainda mais o MTB.

3. Autódromo de MTB

A fim de enriquecer a sua amostra com bactérias magnetotáticas, uma pista de corrida capilar é necessário (Figuras 1B e 1C). Estes necessitam de ser feita antes de isolar as células do recipiente transparente de plástico.
Use uma polegada 5,75 (146 mm) de vidro Pasteur pipeta para fazer uma pista de corrida. Use uma caneta de diamante ou arquivo para cortar a parte superior da pipeta, o comprimento da pipeta não é crucial, mas deve ser capaz de conter aproximadamente 1-2 ml de água. Em seguida, utilizar um bico de Bunsen para derreter a ponta de modo a quetorna-se selado (Figura 1C). A pipeta resultante deve ter uma extremidade aberta e uma extremidade fechada.
Fazer várias dessas pistas e, em seguida, autoclave. Além disso, você terá de autoclave algodão e várias agulhas de metal longos.
Adicionar água de amostra filtrada, recolhida a partir de perto da interface água-sedimento mostrado na Figura 1A, com uma pista de corrida autoclavado utilizando uma agulha de metal longa ligado a uma seringa filtrada. O tamanho dos poros do filtro deve ser 0,22 milímetros para eliminar os detritos e contaminantes da água. É importante ter a certeza absoluta de que não há bolhas de ar no capilar de vidro.
Ligue o fundo da pista com algodão estéril (Figura 1B). Utilize a agulha de metal para empurrar o algodão para a extremidade selada da pista de modo que é de 0,5 - 1 cm de distância entre a ponta fechada (Figura 1C).
Utilizando uma pipeta estéril, adicionar a água MTB contendo (a partir de Secção 2.2) para a amostra de reservoir (extremidade aberta) de uma pista de corridas de MTB preparada (Figura 1B).

4. Enriquecimento MTB

Uma vez que a pista é preenchido com fluido amostra, colocá-lo em seu lado em uma superfície horizontal (por exemplo, uma bancada) e coloque o pólo sul de um ímã de barra (no hemisfério norte) próximo à ponta fechada da pista (Figuras 1B e 1C).
Esperar 5 a 30 minutos para o MTB para migrar através do algodão. Então, você deve coletar o líquido perto da ponta da pista. Espera demasiado longa pode introduzir contaminantes, tais como outras bactérias móveis, para a ponta do capilar. Opcionalmente, você pode usar um microscópio de luz para ver a ponta da pista e ver o MTB recolher na ponta da pista do. Isso permitirá que você para determinar quanto tempo leva o MTB para migrar através do tampão de algodão.
Gentilmente usar a faca de diamante para fazer um pequeno arranhão perto tampão de algodão e tirar fora o fim da pista.
Usando uma seringa de 1 ml com uma agulha fina (25 ou calibre 27), para remover o líquido da ponta da pista. Esta amostra líquida agora deve conter o MTB enriquecido.

5. Observação MTB por microscopia de luz

Colocar uma gota (10-20 ul) da amostra de MTB enriquecido para uma lamela.
Rapidamente virar a lamela mais para que a queda está agora virada para baixo e pendurado na lamela.
Coloque a lamela em um o-ring, que repousa sobre uma lâmina de vidro. O anel de vedação deve ter um diâmetro ligeiramente menor que a lamela (cerca de 1 cm), Figura 2.
Coloque essa queda pendurado em um estágio microscópio de luz e foco em uma borda da gota. Um objectivo 60X seco funciona muito bem, porque a maioria tem uma grande abertura numérica (NA; por exemplo, 0,93), mas não necessitam de óleo, o que é difícil de utilizar para o método de gota em suspensão (Figura 2).
Coloque a extremidade sul de um ímã de barra próximo ao d penduradorop e MTB começará a migrar em direcção ao bordo de queda mais próximo do íman (Figura 3). Dentro de alguns minutos MTB muitos devem estar na borda da gota (Figura 3). Provar-se que as bactérias são magnéticos, invertendo o pólo do íman e em seguida observar a bactéria nadar na direcção oposta.

6. MTB observação por Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM)

Colocar uma gota (~ ul 20) do MTB enriquecido numa grelha de cobre e permitir que as bactérias que se contentar com 10 min.
Wick fora o excesso de água com um pedaço de papel de filtro limpo.
Opcionalmente, a grade pode ser negativamente coradas com acetato de uranilo a 2%, pH 2% de ácido fosfotúngstico 7,2, ou 2,5% de molibdato de sódio ^{7, 8, 9.} Isto é feito através da colocação da grelha de cobre sobre uma gota de corante, imediatamente após a incubação da grade com o MTB enriquecido. Incubar a grade com a mancha negativa, os tempos podem variar, dependendo da rain utilizado, e, em seguida, para fora da mecha de fluido com um pedaço de papel de filtro limpo.
Observe o MTB usando microscopia eletrônica de transmissão (TEM, Figura 4). Para o trabalho descrito aqui MTB foram adsorvidos a Formvar estabilizado e revestidos de carbono 200 redes de malha de cobre (Ted Pella # 01800). As grelhas foram colocados com o lado de carbono para baixo sobre uma gota de suspensão de células para um máximo de 10 min, em seguida, imediatamente lavadas uma vez através da colocação da grade em uma gota de água durante 30 segundos. Para a coloração, as grades foram colocados numa gota de acetato de uranilo a 2% (Ted Pella # 19481) durante 30 segundos a 5 minutos, e depois secou-se completamente através de um pedaço de papel de filtro. As grades foram analisadas por MET usando um FEI Espírito Tecnai em 80kV ou FEI Tecnai F20 usando alto ângulo STEM campo escuro anular em 200KV.