Quantificar as propriedades mecânicas do Glicocálix endotelial com Microscopia de Força Atômica

Resumo

As características mecânicas do glicocálice endotelial foi medida através da indentação utilizando esferas micronizadas em cantilevers de AFM. As células endoteliais foram cultivadas numa câmara de costume em condições de fluxo fisiológicas para induzir a expressão de glicocálice. Os dados foram analisados ​​utilizando um modelo de película fina, para determinar a espessura e módulo de glicocálice.

Resumo

Nossa compreensão da interacção de leucócitos e da parede do vaso durante a captura de leucócitos é limitada por uma compreensão incompleta das propriedades mecânicas da camada de superfície endotelial. Sabe-se que as moléculas de adesão nos leucócitos estão distribuídos de maneira não uniforme em relação à superfície topografia ^3, que a topografia limita a formação da ligação adesiva com superfícies de outros ^9, e que as forças de contacto fisiológicas (≈ 5,0-10,0 pN por microvilosidades) pode comprimir os microvilos como menos de um terço do seu comprimento de repouso, o aumento da acessibilidade das moléculas para a superfície oposta ^{3, 7.} Consideramos que o endotélio como uma estrutura de duas camadas, o corpo da célula, relativamente rígida, mais o glicocálice, um revestimento de açúcar mole protectora na superfície luminal ^6. Tem sido demonstrado que o glicocálice pode actuar como uma barreira para reduzir a adesão de leucócitos ao endotélio de superfície ^4.Neste relatório, nós começamos a abordar a deformabilidade de superfícies endoteliais para entender como a rigidez mecânica endotelial pode afetar a formação de vínculo. As células endoteliais em cultura estática não expressam uma glicocálice robusto, mas as células cultivadas em condições de fluxo fisiológicas começam a aproximar o glicocálice observada in vivo ^2. O módulo de elasticidade do corpo de célula endotelial foi medida através de microscopia de força atómica (AFM) ser aproximadamente de 5 a 20 kPa ^5. A espessura e estrutura do glicocálice foram estudadas utilizando microscopia electrónica de ^8, e o módulo de elasticidade do glicocálice foi aproximada usando métodos indirectos, mas o nosso conhecimento, não existem relatos na literatura de uma medição directa do módulo glicocálice em células vivas . No presente estudo, nós apresentamos experiências feitas com um recuo AFM novel sonda em células que foram cultivadas em condições de maximizar a sua expressão glicocálice de maas medições directas ke do módulo e da espessura do glicocálice endotelial.

Protocolo

1. Métodos

Câmara de caudal 1,1 Célula

A câmara de fluxo, mostrado na Figura 1, foi construído de modo a que as células podem ser cultivadas sob um corte de 1,0 Pa (10 dyn / cm ²⁾ e, em seguida, transferido directamente para uma Asylum MFP3D AFM (Santa Barbara, CA).

1. A câmara de fluxo foi preparado para o ensaio, em primeiro lugar a limpeza das lâminas de vidro, em solução piranha (3:1 H ₂ SO _4: H ₂ O ₂₎ durante 15 min e, em seguida, lavando-as com água destilada. Eles foram então cozidos a seco e revestidos com aminopropil-trietoxi....

Resultados

Numa experiência típica, 20 força-vs-distância curvas foram obtidas a partir de uma dada região de célula, tipicamente na região perinuclear, próximo, mas não sobre, o núcleo (dentro de ~ ^ M 2). As curvas foram alinhados para levar em conta qualquer variação de amostra ao longo da duração da medição e, em seguida, em média, para remover o ruído cantilever, como mostrado na Figura 4. As curvas foram analisadas e se encaixam com o modelo de duas camadas que foi desenvolvido para determinar o módulo de el.......

Discussão

Foram utilizados os valores calculados a partir do modelo de duas camadas e teoria de Hertz para modelar a interacção de um dos leucócitos em circulação no sangue com a parede endotelial. Calculamos que um microvilosidades na leucócitos com um diâmetro de 50 nm sob uma carga de 10 iria pN travessão aproximadamente 150 nm para o glicocálice, apenas uma fracção da espessura total. Isto indica que o glicocálice, com propriedades como medidos nesta experiência, é uma barreira significativa para a interacção célula-célula e .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente / Material	Companhia	Número de catálogo	Comentários
Meio de McCoy	Gibco	16600-082
Fetal Calf Serum	Hyclone	SH30070
Meio de Crescimento de Células Endoteliais	Vec Technologies	MCDB-131
Agrupados células endoteliais da veia umbilical humana	Vec Technologies	PHUVEC/T-25
Ácido sulfúrico	JT Baker	9681-02
Peróxido de Hidrogênio	VWR	BDH3742-1
(3-aminopropil) trietoxissilano	Aldrich	440.140-100ML
Álcool isopropílico	VWR	BDH8999-4
Tripsina	Cellgro	25-054 C1-
Solução salina tamponada de Hank	Gibco	14175-095
sulfo-NHS-LC-Biotina	Thermo Scientific	21335
Contas Streptavadin	Dynabeads	112.06D
MFP-3D AFM	Asylum Research
Cantilevers Cantilever sem	Nanoworld	Arrow-TL1-50
Silhouette SD	Quickutz	Silhueta-SD
Borracha de silicone	Stockwell Elastomerics	SE50-RS
Seringas 30 ml	Benton Dickinson	309650
18 agulhas de calibre	Benton Dickinson	305196
Conjuntos de extensão	Hospira	4429-48
Válvulas de 4 vias	Teleflex	W21372
Masculino / Feminino Caps Porto	Smith Medical	MX491B
Bomba peristáltica	Watson-Marlow	401U / D
Tubulação Peristaltic	Watson-Marlow	903.0016.016
filtros estéreis	Ciências da Vida Pall	4652