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Artigo de método

Em tempo real, análises de Transporte Retinol pelo receptor de membrana da proteína de Retinol Binding

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DOI:

10.3791/50169

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28 de janeiro de 2013

 ,  , 
1Department of Physiology, Jules Stein Eye Institute and Howard Hughes Medical Institute, University of California, Los Angeles

Neste artigo

Resumo

Aqui descrevemos uma técnica otimizada para produzir produtos de alta qualidade vitamina A / complexo RBP e duas técnicas de monitoramento em tempo real para estudar a vitamina A STRA6 transporte, o receptor RBP.

Resumo

A vitamina A é essencial para a visão e o. Crescimento / diferenciação de quase todos os órgãos humanos Plasma proteína de ligação do retinol (RBP) e é o princípio portador específico da vitamina A no sangue. Aqui descrevemos uma técnica optimizada para produzir e purificar a holo-RBP e duas técnicas de monitorização em tempo real para o estudo do transporte da vitamina A por o receptor de alta afinidade RBP STRA6. A primeira técnica torna possível produzir uma grande quantidade de qualidade elevada de holo-RBP (100%-carregadas com retinol) para ensaios de transporte da vitamina A. RBP alta qualidade é essencial para ensaios funcionais devido misfolded RBP lançamentos vitamina A contaminação bacteriana e prontamente na preparação RBP pode causar artefactos. Técnicas de monitoramento em tempo real, como eletrofisiologia fizeram contribuições importantes para os estudos de transporte de membrana. A RBP mediada pelo receptor de transporte de retinol não tenha sido analisado em tempo real até recentemente. A segunda técnica aqui descrita é a real tempo de análise de STRA6 catalisada liberação retinol ou de carga. A terceira técnica é análise em tempo real de STRA6 catalisada transporte retinol de holo-RBP a proteína de ligação do retinol celular I (CRBP-I). Essas técnicas fornecem alta sensibilidade e resolução em revelar vitamina RBP receptor é um mecanismo de captação.

Introdução

A vitamina A é uma molécula orgânica que é essencial para a sobrevivência humana e para o bom funcionamento de quase todos os órgãos humanos. Derivados da vitamina A (retinóides) participar em diversos eventos bioquímicos e celulares, incluindo a detecção de luz para a visão e 1,2 a regulação da expressão do gene e a tradução da proteína durante o desenvolvimento embrionário e em tecidos adultos 3-6. Embora retinol tem a capacidade de se difundir por via sistémica, a evolução veio com plasma de proteína de ligação do retinol, uma proteína transportadora específica para a vitamina A no transporte de sangue para atingir a eficácia e especificidade elevadas e, para evitar a toxicidade associada a difusão aleatória 7-10. Um receptor de alta afinidade que se liga a RBP e leva-se a hipótese de vitamina A no 1970 11-13. Apesar da evidência acumulada em três décadas sobre a existência do receptor RBP 14-31, a hipótese do receptor foi debatida, durante muitos anos devido à existence de uma definição errada de holo-RBP. A definição correcta de holo-RBP é que é o complexo de alta afinidade de 1:1 entre retinol e RBP. Extracção repetida de holo-RBP por solvente orgânico é necessário para a produção de apo-RBP. Esta definição é utilizada por quase todos os laboratórios que estudam RBP 7,9,32-35 ou o receptor RBP 14-31,36-42. A definição incorrecta de holo-RBP que foi usado para provar a existência do receptor RBP é a mistura de retinol aguda livre com apo-RBP. Uma vez que a função do receptor RBP em vitamina A absorção de holo-RBP é a libertação a partir de retinol holo-RBP, o receptor RBP se não desempenham um papel na absorção de retinol se retinol é livre para começar (como proposto pela definição incorrecta de holo -RBP).

A recente identificação de receptor RBP como uma proteína de domínio multitransmembrane chamado STRA636 e a sua função em vitamina A absorção de holo-RBP 36-43 fortemente argumenta contra a hipótese de que não RBPprecisa de um receptor para fornecer análises vitamina A. detalhada revelou que STRA6 tem 9 domínios transmembranares, com o terminal N localizado extracelularmente e C-terminal localizados intracelularmente 40. Localizado entre transmembranar 6 e 7 é um domínio de ligação a RBP essencial 39. STRA6 é acoplada a tanto LRAT e CRBP-I em vitamina A absorção do complexo de holo-RBP, mas nenhum nem LRAT CRBP-I é absolutamente necessário para a actividade melhorada STRA6 41. STRA6 capacidade de catalisar a liberação de retinol holo-RBP é a chave para a sua atividade de vitamina A captação de 41. Confiando em STRA6 para libertar o seu retinol, a vitamina A entrega por RBP pode transportar a vitamina A para alvejar células em tecidos periféricos, com elevada especificidade e eficiência.

A importância crítica de holo-RBP definição e preparação é ilustrada não só pelo histórico debate sobre a existência do receptor RBP, mas também por três relacionados com estudos recentes com base no dif definições holo-RBPrentes da definição original e correta 44-46. O papel utilizado pela primeira vez a definição holo-RBP, que foi utilizado para rejeitar a existência do receptor RBP para estudar o receptor RBP 44. Os artigos segundo e terceiro veio com uma terceira definição de holo-RBP que tornou ainda menos susceptíveis de retinol a ser estudadas de modo a formar um complexo com boa RBP 45,46. Estes estudos preparados através da mistura de 3 H-retinol/RBP holo-RBP (nem apo-RBP), com 3 H-retinol. Uma vez que este ensaio não tem 3 H-retinol/RBP formado e não remover excesso livre 3 H-retinol 45,46, não é um ensaio de absorção de H-3 a partir de 3 H-retinol/RBP retinol, mas é livre 3 ensaio de difusão H-retinol. Foi demonstrado anteriormente que STRA6 não aumenta a absorção celular de retinol livre por LRAT 38 ou CRBP-I 41. Virtualmente todo o retinol é obrigado a RBP no sangue e não existe qualquer detectável free retinol. A principal função do receptor RBP é catalisar libertação retinol de holo-RBP retinol durante a captação de holo-RBP 41. Se o retinol é artificialmente liberado ou está na forma livre, para começar 45,46, o receptor RBP não é necessário. Os resultados dramaticamente diferentes obtidos a partir do ensaio de difusão livre de retinol em comparação com os ensaios baseados em correctamente preparado holo-RBP ilustram que uma correcta preparação de RBP é crucial para os seus ensaios funcionais.

RBP pode ser purificada a partir de soro humano 41, mas o processo é complexo e o rendimento é baixo. Uma abordagem alternativa é a de produzir RBP em E. coli. Porque E. coli não tem a capacidade para dobrar correctamente mamíferos proteínas secretadas com mais de um par de ligações de dissulfureto como RBP, é essencial para a redobragem RBP e purificar a proteína correctamente dobrada. Proteínas deformadas não apenas um comportamento diferente do corrigido RBP dobrado em vários ensaios,mas também fazer com que a agregação da proteína durante a armazenagem. Pela mesma razão, a apo-RBP só é produzido a partir de alta qualidade holo-RBP. Descrevemos aqui um protocolo otimizado para produzir RBP de alta qualidade 100% carregado com retinol através da expressão bacteriana, redobramento, e purificação por HPLC. Purificação por HPLC, não só remove o RBP incorrectamente dobrado, mas também a contaminação bacteriana significativa que pode causar perturbações graves se RBP é usada em ensaios de transdução de sinal. Descrevemos também duas sensíveis técnicas de monitoramento em tempo real para estudar o transporte de retinol por STRA6. Ambas as técnicas dependem RBP alta qualidade. Devido a limitações de espaço, as técnicas clássicas de vitamina retinóide e baseada em HPLC baseado radioativo A captação de ensaios não são descritos aqui.

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Protocolo

1. Produção, redobragem e purificação por HPLC de Holo-RBP

  1. Transformar BL-21cells com o vector pET3a abrigando o ADNc para a RBP humano com sua etiqueta 6x no N-terminal. Crescer as transformadas BL-21 células em um agitador a 37 ° C em 40 ml de meio LB com carbenicilina até OD a 600 nm atingir 0,5. RBP induzir a expressão da proteína por adição de IPTG a 1 mM. Crescer as bactérias a 37 ° C mais 5 horas.
  2. RBP produzido em E. coli é principalmente presente nos corpos de inclusão insolúveis. Para enriquecer a corpos de inclusão, as células de pelotas a 10000 xg durante 20 min. Em seguida, sonicar as células em gelo, em 5 ml de PBS com inibidores de protease, seguido de 2 ciclos de congelamento e descongelamento. Pellet para baixo dos corpos de inclusão a 20.000 xg durante 30 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e guardar o pellet em gelo.
  3. Solubilizar o corpo de inclusão de pelotas por sonicação em 10 ml 7,5 M de hidrocloreto de guanidina. Adicionar metade do volume (5 ml) de tampão Tris 25 mM, pH 9,0 e DTT a um c definitivaoncentration de 10 mM. Misture vigorosamente solução num misturador vortex durante a noite à temperatura ambiente para reduzir totalmente e desnaturar proteínas.
  4. Centrifugar a solução de proteína para remover o material insolúvel a 18.000 xg durante 20 min a 4 ° C. Após a centrifugação, transferir o sobrenadante para um novo tubo e colocar o tubo em gelo.
  5. Prepare quatro volumes (60 ml) de tampão de re-enrolamento (25 mM Tris, pH 9,0, 0,3 mM de cistina, 3,0 mM de cisteína, EDTA 1 mM). Degas buffer do redobragem. Também preparar 600 retinol mM ul 10 em etanol sob luz vermelha ofuscante. Mantê-lo no escuro no gelo. Tanto o tampão de redobragem e solução retinol precisa ser preparada de fresco.
  6. Arrefecer tanto uma solução da proteína e do tampão de redobragem no gelo durante pelo menos 30 min. Temperatura mais elevada provavelmente reduz a qualidade do redobrada RBP. Adicionar gota a gota 1 ml de tampão de redobragem e 10 ul de solução de retinol, por sua vez, enquanto solução de proteína é vigorosamente misturada num copo com gelo. Repita este passo até que todos tampão redobramento e retinolsão adicionados. Manter agitação da reacção em gelo, no escuro, durante 5 horas.
  7. Girar a reacção de redobragem a 24.000 xg durante 30 min a 4 ° C. É essencial para remover os agregados logo após a reacção de redobragem.
  8. Concentra-se a solução sobrenadante utilizando Amicon Ultra concentrador 15 (MWCO 10 K) a cerca de 10 ml. Não se concentrar a solução redobrado mais do que este nível. Concentrando-se demasiado irá conduzir a agregação da proteína e diminui o rendimento final e da qualidade de RBP correctamente dobrado. Dilui-se a amostra concentrada com PBS arrefecido de 100 ml. O propósito deste passo é remover os componentes na reacção de redobragem que interferem com a purificação de níquel.
  9. Girar a solução mais uma vez a 24000 xg durante 20 min a 4 ° C. É importante para remover qualquer precipitado. Transferir o sobrenadante para dois tubos de 50 ml, contendo cada um 1 ml de Ni-NTA de polpa que não foi lavada com PBS. Rodar os tubos a 4 ° C durante uma hora. Incubando f solução diluídaou de 1 hora pode provocar a precipitação de proteínas deformadas que precisam de ser removidos.
  10. Girar os tubos a 500 xg durante 3 min. Remover o sobrenadante cuidadosamente. Flutuante nada deve ser removido. Adicionar PBS frio a 30 ml para cada tubo. Girar novamente e remover o sobrenadante. Repita esse processo até que você não vê nada, mas contas no tubo.
  11. Transferir a resina Ni-NTA de uma coluna vazia. Lavar a resina com 20 volumes de coluna de 10 mM de imidazole, 500 mM de NaCl em PBS. Eluir His-RBP, em 5 volumes de coluna de 100 mM de imidazole em PBS. Não armazenar esta solução por um período prolongado de tempo, e congelamento reduz o rendimento final e qualidade. Para o melhor resultado, purificar RBP por HPLC imediatamente.
  12. Dializar Sua RBP-purificada a partir da resina de Ni-NTA contra 25 mM de Tris, pH 8,4, e NaCl 120 mM. Um concentrador pode também ser utilizado para a troca de tampão. As amostras para HPLC claras por centrifugação a 16.000 xg durante 10 min a 4 ° C para a direita antes de cada execução.
  13. Purifica-se a holo-RBP na HPLC utilizando um iãotroca coluna AX-300 por um gradiente por passos de NaCl (220 mM de 12 min, 360 mM de 15 min, e 1,000 mM de 15 min), utilizando 25 mM de Tris, pH 8,4 como fase móvel a 1 mL / min. Com o aumento da concentração de NaCl, holo-His-RBP é libertado enquanto apo-RBP e misfolded RBP ficar ligado à coluna (Figura 1). Se redobragem RBP não for feito optimamente, misfolded RBP (eg misfolded RBP-I na Figura 1) pode predominar toda a preparação.
  14. Recuperar o enrolamento correcto holo-RBP a partir das fracções de pico a 360 mM NaCl. Monitorizar cuidadosamente o perfil de eluição do enrolamento correcto e misfolded His-RBP. Em 1000 mM de NaCl, a maioria dos misfolded His-RBP deve ser liberado.
  15. As fracções contendo o complexo de holo-RBP são reunidas, concentradas e dialisadas contra PBS durante a noite a 4 ° C. Verifique o rendimento final e qualidade (330 nm/280 nm) em espectrofotômetro. Produto correctamente dobradas deve ter uma razão de 330 nm/280 nm do ligeiramente maior do que 1 (Figura 1).
  16. Para produçãoe apo-RBP, adicionar um volume igual de heptano, para o complexo de holo-RBP purificada e misturar suavemente por rotação durante a noite a 4 ° C. Centrifugar a 16.000 g durante 10 min a 4 ° C e transferir cuidadosamente a fase aquosa inferior para um tubo novo (evitando-se o precipitado na interface). Repita o processo três vezes com uma incubação de 3 horas para cada uma. Verificar a absorção num espectrofotómetro Nanodrop para garantir que o pico 330 nm diminuiu para o nível de fundo.

2. Monitoramento em tempo real de STRA6 catalisada Retinol lançamento e Carregando Retinol

  1. Bloquear um preto de 96 poços da placa de microtitulação-2 (Thermo Scientific) com 200 ul de Casein Blocker (Pierce) durante a noite a 4 ° C para evitar a aderência não específica da holo-RBP ao plástico. Blocker Casein dá o melhor efeito de bloqueio dos bloqueadores todas as soluções testadas.
  2. As membranas preparadas de fresco a partir de células que expressam STRA6 ou células de controlo foram lavados com PBS e passada através de uma seringa de Hamilton (GastiGHT # 1710) 6 vezes para produzir uma suspensão uniforme em PBS. Nós normalmente utilizam membranas derivadas de 1/100 a 1/20 de células cultivadas numa placa de 100 mm por reacção.
  3. Lavar os poços revestidos da placa de microtitulação-2 uma vez com 200 ul de PBS. Arrefece-se a placa em gelo antes da adição da suspensão de membranas (50 uL por poço).
  4. Monitorização em tempo real de retinol fluorescência é medida usando óptica de fluorescência da Omega Polarstar (BMG Labtech) com o 320EX excitação do filtro eo filtro de emissão de 460-10. O programa está definido para o modo de leitura Endpoint. O modo de placa pode também ser usado para medir um curso de tempo, se os intervalos de tempo não são variados. O sinal de cada ponto de tempo é a média de 10 medições (média orbital com um diâmetro de 2 mm) e o ganho é definido para 1800. A placa é agitada durante 10 segundos a 500 rpm utilizando dupla agitação orbital, antes de cada medição.
  5. Para iniciar o teste de libertação de retinol, os poços são lidos uma vez utilizando a leitura Endpoint mode antes holo-RBP (tipicamente a concentração final de 1 uM) é adicionado a 0 min. Assim que a holo-RBP é adicionado, a reacção é monitorizada continuamente min cada 5-10 durante 1-3 hr. Para iniciar o ensaio de carga retinol, all-trans-retinol (tipicamente de 1 uM de concentração final) é adicionado aos poços sob luz vermelha fraca. A placa é lido uma vez antes de apo-RBP é adicionado a 0 min. Assim que a apo-RBP é adicionado, a reacção é monitorizada continuamente min cada 5-10 durante 1-3 hr.
  6. Depois de todas as medições são feitas, o download dos dados em bruto (exemplo mostrado na Figura 2) a partir do software de Análise de Dados Omega (BMG Labtech) para o Microsoft Excel para análise de dados. Cada ponto no tempo gera um arquivo que contém as leituras de todas as condições experimentais. Por exemplo, se houver 20 pontos no tempo, consolidar 20 arquivos em um arquivo do Excel para análise de dados.
  7. Para a análise dos dados, os sinais de fluorescência antes da adição de retinol ou holo-RBP a 0 min são considerados sinais de fundo umad subtraídos dos sinais finais de fluorescência em todos os pontos de tempo. Embora os sinais de fundo é baixo comparado com retinol fluorescência em holo-RBP, subtraindo-se o fundo não específico elimina a influência de dispersão da luz pelas membranas e possibilita a concentrar-se na fluorescência do retinol de holo-RBP ou retinol adicionado a 0 min.

3. Monitoramento em tempo real de STRA6 catalisada Transporte de Retinol De Holo-RBP para CRBP-I

  1. Retinol-EGFP é uma transferência de ressonância novo fluorescência (FRET) par que foi recentemente estabelecido 41. STRA6 catalisada transporte de retinol holo-RBP para EGFP-CRBP-I é monitorado em tempo real através da medição de retinol-EGFP FRET. EGFP-CRBP-I a proteína de fusão com 6xHis tag (EGFP-CRBP-I) é produzida em células de mamíferos e é purificado em resina Ni-NTA antes da experiência. EGFP-CRBP-I pode ser armazenado em PBS com os inibidores de protease por um curto período de tempo, a 4 ° C. Alternativamente a proteína de fusão is congeladas a -80 ° C em pequenas aliquotas.
  2. Antes das reacções, preparar uma placa de microtitulação bloqueadas-2 e as membranas tal como descrito acima. Lavar os poços revestidos da placa de microtitulação-2 uma vez com 200 ul de PBS antes da adição da suspensão de membranas (50 uL por poço).
  3. Real-time retinol-EGFP FRET é medida usando polarstar Omega com a excitação 320EX filtro e os filtros de emissão de 460-10 e 510-10 usando simultâneas duelo óptica de emissão de fluorescência. O programa está definido para o modo de leitura Endpoint. O modo de placa pode também ser usado para medir um curso de tempo, se os intervalos de tempo não são variados. O sinal de cada ponto de tempo é a média de 10 medições (média orbital com um diâmetro de 2 mm) e o ganho é fixado em 1800 por canal. A placa é agitada durante 10 segundos a 500 rpm utilizando dupla agitação orbital, antes de cada medição.
  4. Para iniciar as reacções, EGFP-CRBP-I (tipicamente de 1 uM de concentração final) é adicionado aos poços. A placa é lida emce utilizar o modo de leitura Endpoint antes de holo-RBP é adicionado a 0 min. Assim que a holo-RBP é adicionado, a reacção é monitorizada por medição continuamente a cada 5-10 min para hr 1-2.
  5. Depois de todas as medições são feitas, o download dos dados em bruto (exemplo mostrado na Figura 3) a partir do software de Análise de Dados Omega para Microsoft Excel para análise de dados, tal como descrito acima.
  6. Retinol-EGFP FRET é calculada pela mudança dinâmica na relação dos picos de aceitador / dador de emissão 47. A equação 41 para calcular essa proporção é [(510 t -510 b) / (460 t -460 b)], onde t 510, 510 b, 460 t, b e 460 representam as emissões em 510 nm após o início da reacção ( t = tempo de ponto), a 510 nm antes de retinol ou holo-RBP é adicionado (b = branco), a 460 nm após a iniciação da reacção de (t = ponto de tempo), e a 460 nm antes de retinol ou holo-RBP é adicionada (b = fundo), respectivamente.

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Resultados

Apresentamos aqui os resultados representativos para holo-RBP produção e purificação por HPLC (Figura 1), em tempo real A análise de STRA6 catalisada libertação retinol de holo-RBP e carregamento de retinol em apo-RBP (Figura 2) e análise em tempo real de STRA6 catalisada transporte retinol de holo-RBP a EGFP-CRBP-I (Figura 3).

Sem a redobragem, RBP produzido em bactérias é quase completamente misfolded devido à presença de muitas ligações d...

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Discussão

Compartilhamos aqui um protocolo de produção otimizada RBP porque os procedimentos de produção e purificação da RBP são críticos para a geração de RBP corretamente dobrado. Dada a possibilidade de espécies RBP deformadas e a presença de quantidades residuais de proteínas bacterianas, mesmo em bactérias purificada por HPLC-produzidos RBP, é útil utilizar RBP nativa do soro para confirmar a conclusão relacionada a RBP. RBP urina, o qual está comercialmente disponível, é uma mistura complexa de várias espécies de RBP inclu...

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Divulgações

Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

Apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde concessão R01EY018144.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Nome do reagente / Material Companhia Número de catálogo Comentários
cloridrato de guanidina EMD 5010
cistina Sigma C8755
cisteína Sigma C7352
EDTA Pescador BP118-500
Tris Pescador 7786-1
TDT EMD 3860
retinol Sigma R7632
carbenicilina Pescador BP2648-5
IPTG EMD 5810
PBS EMD 6508
NaCl Pescador BP358-10
Ni-NTA Qiagen 1018244
imidazol EMD 5720
heptano EMD HX0295-1
Bloqueador de caseína Perfurar 37528
Amicon Ultra 15 concentrador (MWCO10 K) Millipore UFC901024
-2 placa de microflúor Pescador 14-245-177
Hamilton seringa estanque ao gás # 1710 Pescador 14-824-655

Referências

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