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Condicionado tátil e Análise do Movimento de estratégias de amostragem antenais de abelhas (

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DOI:

10.3791/50179

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12 de dezembro de 2012

 ,  ,  , 
1Biological Cybernetics, CITEC - Cognitive Interaction Technology - Center of Excellence, Bielefeld University

Neste artigo

Resumo

Neste protocolo, mostramos como condição aproveitado abelhas aos estímulos táteis e introduzir uma técnica de captura de movimento 2D para analisar a cinemática de multa escala padrão de amostragem antenal.

Resumo

As abelhas melíferas (Apis mellifera L.) são insetos eussociais e bem conhecidos por sua complexa divisão do trabalho e capacidade de aprendizagem associativa 1, 2. As abelhas operárias passar a primeira metade de sua vida dentro da colméia escuro, onde estão as larvas de enfermagem ou a construção dos favos hexagonal regular de alimentos (por exemplo, pólen ou néctar) e prole 3. As antenas são extraordinários antenas multissensoriais e desempenham um papel fundamental em diversas funções táteis mediadas 4, incluindo a construção colméia 5 e 6 de reconhecimento de padrões. Mais tarde na vida, cada única abelha deixa a colméia para procurar alimentos. Em seguida, uma abelha tem que aprender a discriminar fontes de alimento rentáveis, memorizar a sua localização, e comunicar a seus companheiros de ninho 7. As abelhas utilizam diferentes sinais florais como cores ou odores 7, 8, mas também pistas tácteis da superfície pétala 9 para formar memórias multissensoriais da fonte de alimentação. Em laboratório conditions, as abelhas podem ser treinadas em um paradigma de aprendizagem apetitiva discriminar características do objeto tátil, como bordas ou sulcos com suas antenas 10, 11, 12, 13. Este paradigma da aprendizagem é estreitamente relacionado com o condicionamento clássico olfactory extensão da resposta tromba (PER) em abelhas encapsuladas 14. A vantagem do modelo de aprendizagem tátil no laboratório é a possibilidade de combinar as experiências comportamentais na aprendizagem com várias medições fisiológicas, incluindo a análise do padrão de movimento da antena.

Protocolo

1. Preparando as abelhas

  1. Forrageiras néctar ou pólen são capturados no campo a partir de um alimentador de sacarose ou diretamente a partir da entrada colméia ao retornar de uma viagem de forrageamento. Cada única abelha é capturado dentro de um frasco de vidro, que é fechada com um tampão de espuma e levado imediatamente para o laboratório para posterior manipulação.
  2. No laboratório, as abelhas capturados são brevemente arrefecida no frigorífico a 4 ° C até se mostrar os primeiros sinais de imobilidade.
  3. Cada abelha única imobilizada é montado em um pequeno tubo de metal com fita adesiva entre a cabeça e no tórax e sobre o abdómen. Cuidados devem ser tomados para que a tromba e antenas são livremente móvel.
  4. Pinte os olhos compostos e ocelos da abelha fixo com tinta branca (por exemplo, livre de solvente Tipp-Ex) para ocluir visão.
  5. Adicionar uma pequena gota de cera derretida por trás da cabeça da abelha para corrigi-lo para a fita entre a cabeça eo tórax para evitar movimentos da cabeça durante as gravações.
  6. Marcar cada abelha com um número único na fita para facilitar a identificação e colocar o tubo com a abelha fixo em uma atmosfera húmida para evitar a desidratação.
  7. Alimentar cada abelha único durante 5 segundos, com gotículas de uma solução de sacarose a 30% apresentaram uma seringa e que todas as abelhas recuperar durante 30 min antes de iniciar o protocolo de condicionamento táctil.

2. Condicionado tátil

  1. Antes de condicionamento, cada abelha individual tem de ser testado para a resposta da extensão da probóscide (PER) a um estímulo de 30% de sacarose aplicada às antenas. Deste modo, a ponta do nariz tem de atravessar uma linha virtual entre as mandíbulas abertas. Descartar todas as abelhas que não respondem com um PER para o estímulo de sacarose.
  2. Para o condicionamento táctil utilizar um cubo de metal (por exemplo, 3 x 5 mm) com uma superfície lisa ou um padrão gravado, por exemplo, horizontal ou ranhuras verticais que formam uma grade com comprimento de onda de 150 um, como o estímulo condicionado (CS). Fou o estímulo não condicionado (EUA) utilizar uma solução de sacarose a 30% (açúcar doméstico, diluído em água).
  3. O cubo de latão (CS) é colocado sobre um suporte de um micromanipulador (por exemplo, Märzhäuser MM33) para garantir o posicionamento exacto durante o processo de condicionamento. Os EUA é apresentada ao abelha com uma seringa cheia com uma solução de sacarose a 30%.
  4. O procedimento de condicionamento consiste em cinco pares de estímulo táctil (CS) e uma solução de sacarose (EUA), com um intervalo inter-ensaio (ITI) de 5 min. Colocar uma única abelha em frente do micromanipulador com o estímulo táctil montado (CS). Posicionar o CS lentamente, de tal modo que a superfície do estímulo táctil é paralela à cabeça da abelha (Figura 1 A e B). A distância entre o animal e o objeto tátil deve estar no intervalo de o raio da antena de trabalho da abelha testado, isto é, a abelha deve ser capaz de verificar o estímulo táctil numa posição confortável wantenas tanto de ordem i. No exemplo mostrado na Figura 1, a distância era de 3 mm. Deixe a abelha digitalizar o estímulo tátil (CS) por 5 seg. Após o primeiro 3 seg, apresentar uma gotícula da sacarose a 30% (EUA) com uma solução de uma seringa sob a tromba. Utilize a ponta da seringa para levantar suavemente as tromba. Estimulação de sacarose sob a tromba vai provocar o incondicionado PER 15. Permitir que a abelha a lamber a recompensa de sacarose. Usar um cronometro com um sinal de alarme para manter os intervalos exactos de tempo durante o condicionamento.
  5. O PER condicionado é usada como uma medida para o sucesso da aprendizagem de uma abelha. Após os sorteios primeiro recompensados, as abelhas começam a responder a CS apresentação por extensão de seus probóscides, indicando que eles esperam a recompensa futura. A tromba totalmente estendida observados a qualquer momento durante a janela de tempo de 3 segundos de apresentação do estímulo tátil e antes da apresentação de sacarose é classificada como uma resposta positiva. Nenhuma resposta é contado negativo. O occurrence do PER tem de ser observado pelo experimentador. O percentual de abelhas que mostram o PER durante a apresentação CS é traçado para cada tentativa.

3. Gravações cinemáticas

  1. Movimentos antenais de uma única abelha aproveitado são gravados com uma câmera de vídeo digital com uma lente macro adequado (por exemplo Basler A602f-2 equipado com TechSpec VZM 200, operado a 50 fps através de uma conexão de fio de fogo). A câmara é posicionada acima do animal numa vista de cima para baixo (Figura 1 A). Na Figura 1, a resolução espacial das gravações é de 0,02 mm / pixel.
  2. Calibrar a câmera gravando imagens únicas de um tabuleiro de xadrez 10 mm x 10 com uma aresta de comprimento 1 mm diferentes orientações no âmbito do objectivo da câmara. A calibração pode ser feita com a caixa de ferramentas da câmara de calibração Matlab 16.
  3. Coloque uma única abelha fixa abaixo da lente da câmera. Apresentar o estímulo táctil, fixada a um micromanipulador, Para o animal. Proceder do mesmo modo como descrito para o condicionamento táctil, e gravar o movimento da antena enquanto a abelha é digitalizar o objeto. É importante que o intervalo de trabalho completo e antenal do estímulo táctil são visíveis. As escolhas de padrões de estímulo testado e números de ensaios dependem do projeto experimental.

4. Análise de Dados

  1. O cálculo da imagem de fundo é feito em Matlab. Primeiro, o valor médio tons de cinza ao longo do tempo tem que ser calculado para cada pixel. Objetos estáticos, como a cabeça fixa da abelha e do estímulo tátil, irá constituir o fundo da imagem. Os objectos em movimento, como a duas antenas, não irá fazer parte do fundo.
  2. Cada quadro do vídeo gravado deve ser carregada sequencialmente, e a diferença entre a imagem actual e a imagem de fundo tem de ser calculada. O resultado desta subtração enfatiza as partes da imagem que está se movendo de um quadro para outro. Ideally, as antenas da abelha são as únicas áreas de valores diferentes de zero (Figura 1C).
  3. Para processamento adicional, as duas maiores áreas com valores diferentes de zero de pixel são assumidos como sendo as antenas. Para ambas as antenas de uma máscara binária deve ser gerado para cada pixel contendo um valor de 1, se o pixel pertence à antena e 0 valor de outra forma. Esta máscara serve como uma base para a localização das pontas antenais mais tarde. Para ganhar uma máscara preliminar para a totalidade da imagem do cinzento-valor de cada pixel da imagem de diferença é comparada com um limiar pré-definido. Desde que cuidar de ruído ainda este limiar é escolhido para ser bastante baixa. A máscara de preliminar, então ainda tem dois tipos de erros: em primeiro lugar, devido a regiões da imagem de ruído pequenas ainda fazem parte da máscara. Em segundo lugar, as superfícies que pertencem à antena pode não ser necessariamente totalmente ligado. A última ocorre principalmente quando o fundo tem aproximadamente a mesma que a luminescência da antena. Para eliminar esses artefatos, padrãooperação de processamento de imagem morfológica são aplicadas, ou seja, uma combinação de imagem erosão e dilatação, contando com as funções padrão do Matlab imerode e imdilate respectivamente (ver 17 pp 158-205 para mais explicações). Após o processo de suavização das hipóteses antenas estão ainda contidos no interior da mesma máscara. Assim, como um próximo passo a máscara binária é agrupado para áreas disjuntas usando o padrão Matlab função bwlabel (veja 17 pp 40-48 para mais detalhes sobre o algoritmo de segmentação de imagem).
  4. O número de pixels por cluster é contado e os dois maiores grupos são selecionados. O centro de gravidade é calculada para distinguir entre a antena do lado esquerdo e direito (Figura 1D).
  5. A ponta da antena para cada antena pode ser definida como o pixel de um agrupamento com o valor mais elevado na direcção proximal para distal (ver Figura 1D).

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Resultados

No experimento seguinte estudou como o aprendizado afeta o comportamento tátil amostragem antenais de abelhas. Para isso, é monitorado o movimento da ponta da antena de abelhas naive e condicionado antes e durante a apresentação de um estímulo táctil.

Em primeiro lugar, o movimento espontâneo antenal de um grupo de forrageadoras pólen (N = 42) foi registado durante 1 min. Metade das abelhas (N = 21) foi, em seguida, condicionado por emparelhamento cinco vezes um estímulo táctil com uma recom...

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Discussão

Preparação das abelhas: Coleta e fixação das abelhas deve ser feito rapidamente, a fim de manter o nível de estresse do baixo animal. O stress tem um efeito sobre a capacidade de resposta PER-e, portanto, pode ter um efeito indirecto sobre o desempenho da aprendizagem em abelhas 19, 20. O nível de tensão pode ser reduzida ao colocar os frascos de vidro com as abelhas directamente em gelo imediatamente após a colheita para imobilizá-los rapidamente. Tem que ser tido em conta que as abelhas pre...

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Divulgações

Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

Agradecemos Joachim Erber por nos apresentar o paradigma de aprendizagem tátil em abelhas. Este trabalho foi apoiado pelo Cluster de Excelência 277 CITEC, financiado no âmbito da Iniciativa de Excelência alemão.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Nome do reagente / Material Companhia Número de catálogo Comentários
Forrageiras pólen, Apis mellifera L. Colméias privadas
Frascos de vidro (22 x 45 mm) Carl Roth GmbH & Co X655.1
Tubos de bronze, 10 x 30 mm Auto-produzido
Cubo de latão, 3 x 5 mm Auto-produzido
Tipp-Ex (sem solventes) Tipp-Ex GmbH & Co KG
Solução de sacarose (30%) Suger casa diluído em água
Etanol (70%) Carl Roth GmbH & Co 9065,3
Seringa (1 ml) e agulha (0,6 x 25) Carl Roth GmbH & Co 59,1
Cronômetro Carl Roth GmbH & Co L423.1
Micromanipulador Märzhäuser MM33 00-42-101-0000
Câmera de vídeo digital Basler A602f-2
Lente macro para a câmera TechSpec VZM 200
Matlab R2009b The MathWorks

Referências

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