Medindo o transporte de catiões de Na, K e H, K-ATPase em<em&gt; Xenopus</em&gt; Oócitos por espectrofotometria de absorção atômica: uma alternativa para Ensaios de Radioisótopos

Resumo

Descrevemos um método para quantificar a atividade de ATPases do tipo P de contratransporte de K⁺ pela expressão heteróloga das enzimas em oócitos de Xenopus e medindo a captação de Rb⁺ ou Li⁺ em células individuais por espectrofotometria de absorção atômica. O método é uma alternativa sensível e segura aos experimentos de fluxo de radioisótopos, facilitando estudos cinéticos complexos.

Resumo

Enquanto o transporte de cátions pelo transportador de membrana eletrogênica Na⁺,K⁺-ATPase pode ser medido por eletrofisiologia, a H⁺,K⁺-ATPase gástrica operando eletroneutramente é mais difícil de investigar. Muitos ensaios de transporte utilizam radioisótopos para atingir uma relação sinal-ruído suficiente, no entanto, as medidas de segurança necessárias impõem restrições severas em relação à exposição humana ou ao projeto do ensaio. Além disso, o transporte de íons através das membranas celulares é criticamente influenciado pelo potencial de membrana, que não é diretamente controlado em cultura de células ou em preparações de proteolipossomas. Aqui, fazemos uso da excelente sensibilidade da espectrofotometria de absorção atômica (AAS) para vestígios de elementos químicos para medir o transporte de Rb ⁺ ou Li ⁺ por Na⁺, K⁺- ou H⁺, K⁺-ATPase gástrica em células individuais. Usando oócitos de Xenopus como sistema de expressão, determinamos a quantidade de Rb⁺ (Li⁺) transportada para as células medindo amostras de homogeneizados de oócitos únicos em um dispositivo AAS equipado com um forno atomizador de grafite aquecido transversalmente (THGA), que é carregado de um amostrador automático. Uma vez que o histórico de captação inespecífica de Rb⁺ em oócitos de controle ou durante a aplicação de inibidores específicos da ATPase é muito pequeno, é possível implementar esquemas complexos de ensaios cinéticos envolvendo um grande número de condições experimentais simultaneamente, ou comparar a capacidade de transporte e a cinética de transportadores mutantes específicos do local com alta precisão. Além disso, como a captação de cátions é determinada em células individuais, os experimentos de fluxo podem ser realizados em combinação com o clampeamento de tensão de dois eletrodos (TEVC) para obter um controle preciso do potencial e da corrente da membrana. Isso permitiu, por exemplo, determinar quantitativamente a estequiometria de transporte 3Na⁺/2K⁺ da Na⁺,K⁺-ATPase e permitiu, pela primeira vez, investigar a dependência de voltagem do transporte de cátions pela H⁺,K⁺-ATPase gástrica de operação eletroneutra. Em princípio, o ensaio não se limita a proteínas de membrana transportadoras de K⁺, mas pode funcionar igualmente bem para abordar a atividade de transportadores de metais pesados ou de transição, ou a absorção de elementos químicos por processos endocitóticos.

Introdução

Queríamos desenvolver uma alternativa sensível, segura e barata aos experimentos com traçadores radioativos para investigar a atividade de transporte específica de proteínas de membrana translocadoras de íons, a fim de contornar as restrições relativas ao acesso a laboratórios de isótopos, requisitos de segurança ou o uso de radioisótopos caros, que - como no caso do lítio - podem até estar indisponíveis devido a tempos de decaimento extremamente curtos. Estávamos particularmente interessados em determinar a atividade da H⁺,K⁺-ATPase gástrica operando eletroneutramente, porque a enzima não gera corrente e, portanto, sua atividade não pode ser tratada por métodos eletrofisiológicos. Uma vez que a Na⁺,K⁺- e a H⁺,K⁺-ATPase transportam Rb⁺ tão eficientes como K⁺ (e Li⁺ também), a elevada sensibilidade da técnica AAS para rubídio ou lítio deve facilitar a detecção sensível da atividade de transporte. Os espectrofotômetros de absorção atômica são dispositivos analíticos comuns, amplamente distribuídos em laboratórios químicos e devem ser acessíveis a um grande número de cientistas interessados. Além disso, queríamos aproveitar o sistema de expressão de oócitos Xenopus, que utiliza grandes células únicas (cerca de 1,0-1,5 mm de diâmetro) que permitem alcançar uma variabilidade célula a célula notavelmente baixa em relação ao nível de expressão de proteínas em um único lote. Um cálculo simples demonstra a viabilidade do ensaio AAS: O limite de detecção (massa característica) para rubídio com a técnica THGA-AAS é de 10 pg ou 1,2 · ^10-13 mol (Rb: 85,47 g / mol), para lítio 5,5 pg ou 7,9 · ^10-13 mol (Li: 6,94 g / mol). Após a expressão heteróloga de Na⁺,K⁺-ATPase em oócitos de Xenopus, correntes de bombeamento de 100 nA podem ser alcançadas (o que equivale a cerca de 6,2·1011 cargas elementares por segundo, ou 1,03·10-12 mol ^s-1), resultando assim em um transporte de 6·^10-6 C de carga em 1 min. Como o transporte de uma carga líquida corresponde à absorção de dois íons Rb⁺ (devido à estequiometria 3Na⁺/2K⁺), a corrente de 100 nA por 1 min corresponde a uma captação de 1,2·^10-10 mol Rb⁺. Assim, mesmo após uma diluição de 1.000 vezes (homogeneização de um oócito com cerca de 1 μl de volume em 1 ml de água), uma amostra típica de THGA-AAS (20 μl) contém 2,4·^10-12 mol Rb⁺ (ou 204 pg), que está muito acima do limite de detecção. Portanto, mesmo transportadores com atividade de transporte ou expressão de membrana plasmática mais de 100 vezes menor podem ser testados com a técnica ajustando adequadamente o tempo de fluxo do experimento.

Uma vez que a taxa de bombeamento depende sensivelmente da temperatura (as energias de ativação típicas para Na⁺,K⁺-ATPase estão na faixa de 90 kJ/mol a 130 kJ/mol^1-3, o que resulta em um aumento de cerca de 30% na taxa de rotatividade após uma mudança de 20 °C para 22 °C), é obrigatório realizar as medições de fluxo sob controle preciso de temperatura (ar condicionado) com soluções tampão bem equilibradas. Além disso, os oócitos devem ser cuidadosamente selecionados em relação ao tamanho homogêneo para a expressão de um transportador de íons. Com essas precauções, é possível atingir rotineiramente erros padrão experimentais de menos de 10% com cerca de 10 células por condição experimental. Usando esta técnica, fomos capazes de determinar, por exemplo, as afinidades aparentes de Rb ⁺ do transporte de cátions^4-6, a influência^{do pH 7} extra e intracelular e o efeito de mutações de resíduos envolvidos na coordenação de cátions durante o transporte^4,8. Uma vantagem da técnica é que os fluxos de íons também podem ser determinados em combinação com o clampeamento de tensão de dois eletrodos dos oócitos, o que, por um lado, garante o controle preciso do potencial da membrana durante o transporte e, por outro lado, permite correlacionar o fluxo de íons com a corrente da membrana. Assim, foi possível verificar a estequiometria 3Na⁺/2K⁺ da Na⁺,K⁺-ATPase (ver resultados exemplares abaixo) e determinar a dependência da voltagem do transporte catiônico da H⁺/K⁺-ATPase gástrica⁷.

Protocolo

1. Construções de cDNA e Expressão Proteica em Oócitos de Xenopus

O DNAc da proteína de membrana de interesse deve ser clonado em um vetor adequado para expressão em oócitos de Xenopus laevis, como pTLN⁹ ou pcDNA3.1X¹⁰. Tais vetores otimizados contêm as regiões não traduzidas 5' e 3' (UTR) do gene β-globina de Xenopus laevis que flanqueiam o local de clonagem múltipla (MCS), uma sequência promotora de RNA polimerase (pTLN: SP6, pcDNA3.1X: T7) localizada antes da UTR 5', um trecho de poli-A na direção 3' do MCS para garantir a estabilidade do cRNA nas células, e mais a jusante outra sequência de sítios de enzimas de restrição de corte único para linearização do plasmídeo, a fim de servir como molde para a transcrição in vitro de cRNA.

Para distinguir a atividade da Na⁺/K⁺-ATPase humana superexpressa (subunidade α₂ + subunidade β₁) da Na⁺/K⁺-ATPase endógena dos ovócitos, as mutações Q116R e N127D foram introduzidas para obter uma proteína resistente à ouabaína com uma IC50 na faixa de milimolar¹¹. No caso da H⁺/K⁺-ATPase, as medidas de fluxo foram realizadas utilizando o mutante da subunidade α da H⁺/K⁺-ATPase S806C, já que os fluxos de Rb⁺ foram correlacionados com dados cinéticos de experimentos de fluorimetria por fixação de voltagem (VCF). A técnica de VCF (https://www.jove.com/video/2627/ examining-the-conformational-dynamics-of-membrane-proteins-in-situ-with-site-directed-fluo rescence-labeling)¹² baseia-se na ligação específica de um fluoróforo a um resíduo de cisteína introduzido estrategicamente, o qual relata as mudanças conformacionais da enzima.

2. Linearização e Purificação do Modelo de DNA

1. Para a linearização do molde de DNA, digira 3 μg de DNA plasmidial em um volume de reação de 50 μl com 5 μl de tampão 10x concentrado apropriado para a enzima de restrição e 10 U da enzima de restrição por 1 hora a 37 °C.
2. Purifique o DNA linearizado utilizando o Kit de Purificação de Produtos de PCR High-Pure (Roche Applied Science). Primeiro, adicione 350 μl de tampão de ligação (contendo guanidinioisotiocianato) ao frasco da digestão. Após esta etapa de purificação, o molde de DNA linearizado é de "grau para RNA", pois o guanidinioisotiocianato é um desnaturante proteico eficiente e destrói, em particular, a RNase, que é um contaminante frequente em laboratórios de biologia molecular.
3. Insira as colunas de centrifugação em tubos coletores, adicione à coluna a solução de DNA do passo 2, centrifugue a 13.000 x g por 30 segundos e descarte o fluxo passante.
4. Adicione 500 μl de tampão de lavagem à coluna. Centrifugue por 1 minuto a 13.000 x g e descarte o fluxo passante.
5. Adicione 200 μl de tampão de lavagem à coluna. Centrifugue por 1 minuto a 13.000 x g para secar completamente a coluna.
6. Coloque a coluna de centrifugação em um novo tubo Eppendorf de 1,5 ml e adicione 50 μl de água livre de nucleases (Ambion Produto nº AM9937) à coluna. Elua por centrifugação por 1 minuto na velocidade máxima.
7. Após a eluição, concentre a solução contendo DNA para cerca de 15 μl. Este passo garante que a solução contenha 0,5 μg de DNA linearizado em 3 μl, que é a concentração recomendada para a reação seguinte de transcrição in vitro de cRNA.

3. Síntese in vitro de cRNA

1. Escolha o kit mMessage mMachine apropriado (Ambion Produto #1340, #1344) de acordo com a sequência do promotor no plasmídeo (SP6, T7). Em um volume total de reação de 10 μl, adicione 3 μl de DNA linearizado do passo anterior e 1 μl de tampão de transcrição às amostras pré-alicotas de 5 μl da mistura NTP-cap. A pré-aliquotação da mistura NTP-cap é necessária para evitar ciclos frequentes de congelamento e descongelamento, o que pode levar à degradação dos nucleosídeos trifosfatos. Por fim, adicione 1 μl da polimerase de RNA apropriada, misture brevemente e centrifugue a mistura de reação.
2. Incube a mistura de reação por 1 a 2 horas a 37 °C. O tempo de incubação não deve exceder 2 horas, pois isso pode resultar em menor rendimento ou qualidade de cRNA.
3. Adicione 15 μl de solução de LiCl 3 M gelada proveniente do kit, 15 μl de água fria livre de nucleases, misture brevemente (não agite em vórtex), centrifugue brevemente a 11.000 x g por 10 segundos e armazene a -20 °C por pelo menos 30 minutos para permitir a precipitação do cRNA.
4. Resfrie previamente a centrífuga a 4 °C e centrifugue por pelo menos 15 minutos a 13.000 x g após a precipitação.
5. Remova cuidadosa e completamente o sobrenadante do pellet marrom-claro no fundo do tubo e adicione 150 μl de etanol 70% grau RNA resfriado a -20 °C. Centrifugue a 4 °C por 5 minutos a 13.000 x g.
6. Remova completamente o sobrenadante e seque brevemente (1-2 minutos) o pellet restante de cRNA em um evaporador centrífugo (e.g. modelo Eppendorf Concentrator 5301) à temperatura ambiente.
7. Resolva o pellet em 12 μl de água fria livre de nucleases. ATENÇÃO: Todos os passos subsequentes devem ser realizados mantendo a amostra de cRNA armazenada em gelo.
8. Determine a concentração de cRNA utilizando um espectrofotômetro (e.g. Eppendorf BioPhotometer).
9. Verifique a integridade do cRNA por eletroforese em gel de agarose. ATENÇÃO: Esta verificação cruzada é necessária, pois até mesmo RNA parcialmente degradado apresenta absorção de UV diferente de zero. Para eletroforese de cRNA, utilize uma câmara de eletroforese completamente limpa, recém-preenchida com tampão TAE e um gel de agarose 1% recém-preparado. Caso haja suspeita de contaminação por RNase na câmara de eletroforese ou no tampão, encha a câmara com HCl 0,1 M por 1 hora para limpeza e prepare o tampão TAE com água livre de nucleases.
10. Armazene o cRNA a -20 °C até o uso. O cRNA pode ser armazenado por pelo menos um ano a -20 °C.

4. Obtenção de Material de Ovário de Fêmeas de Xenopus laevis por Ovarectomia Parcial

Este protocolo foi aprovado pela autoridade estadual responsável (Landesamt für Gesundheit und Soziales Berlin, The Senate of Berlin, Alemanha).

1. Não alimente o sapo por pelo menos 12 horas antes da cirurgia para evitar vômitos.
2. Prepare uma solução contendo 2 g do anestésico local tricaina (MS-222) dissolvidos em 1 L de água ajustada a pH 7,0 com tampão HEPES 5 mM. ATENÇÃO: Use luvas de nitrila durante todo o manuseio do MS-222 e prepare a solução em uma cabine de segurança química.
3. Mergulhe o sapo na solução de tricaina (no máximo 10 min) até que o animal não apresente mais reflexos de endireitamento. Para verificar a ausência de resposta, tente virar o sapo de costas em suas mãos e observe a presença de movimentos de defesa.
4. Retire o sapo da solução de tricaina manualmente e enxágue o animal com água da torneira fria para remover o anestésico.
5. Coloque o sapo com as costas voltadas para cima sobre uma cama de gelo coberta com um papel toalha úmido para evitar danos à pele do sapo por contato direto com o gelo. Mantenha a pele do animal úmida durante toda a operação para evitar ressecamento. A colocação sobre o gelo prolonga o tempo de anestesia.
6. Faça uma pequena incisão abdominal (comprimento de 8-10 mm) com tesoura afiada, no lado esquerdo ou direito da linha média do sapo. ATENÇÃO: Tenha cuidado para não lesionar a linha lateral. Cirurgias subsequentes devem ser realizadas em lados alternados para permitir uma boa recuperação do tecido ovariano subjacente. Normalmente, é necessário penetrar três camadas de tecido (a pele externa, uma fina camada de tecido conjuntivo branco – a fáscia – e uma camada muscular).
7. Após a abertura do abdômen, segure partes dos lobos ovarianos com pinça romba e puxe suavemente para o exterior. Como orientação, remova cerca de 3-5 cm de tecido ovariano por meio de incisão. Em caso de lesão de pequenos vasos sanguíneos e sangramento, aplique pressão com uma haste plástica estéril ou resfrie a lesão com gelo até que o sangramento cesse.
8. Feche cirurgicamente a incisão utilizando padrão de sutura interrompida com fio 4.0 Ethicon Vicryl (Johnson & Johnson #V633H). Use instrumentos cirúrgicos para suturar e dê dois ou três nós separados ao longo da incisão. ATENÇÃO: É importante que cada nó prenda as três camadas de tecido em um único passo.
9. Após a cirurgia, coloque o sapo em uma bacia com água levemente inclinada (30 L), contendo apenas água suficiente para cobrir o fundo, de modo que as narinas do animal fiquem acima do nível da água para permitir a respiração. Cubra o animal durante o período de recuperação (cerca de 1-2 horas) com um papel toalha úmido para evitar o ressecamento da pele sensível.
10. Quando o animal estiver novamente ativo, encha a bacia com água e mantenha o sapo separado dos demais animais por 3-4 dias para monitorar a recuperação e a cicatrização da ferida.
11. Após a cirurgia, evite submeter o sapo a novas operações por pelo menos 3 meses para permitir a recuperação completa do animal e de seu tecido ovariano. Como orientação, pode-se realizar no máximo 6-8 cirurgias em cada sapo.

5. Isolamento Enzimático de Oócitos Individuais

1. Corte o material ovariano em pedaços menores com tesoura e transfira o tecido para a Solução Ringer para Oócitos sem Ca²⁺ (110 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 5 mM HEPES, pH 7,4) contendo colagenase (20 mg/ml, tipo 1A de Clostridium hystolyticum, Sigma #C9891) e inibidor de tripsina (10 mg/ml, Tipo III-O de clara de ovo de galinha, Sigma #T2011).
2. Agite suavemente a solução de digestão por 2,5 h a 18 °C. Posteriormente, acompanhe o progresso da digestão em intervalos de 15 min até que a maioria dos oócitos esteja separada do tecido folicular.
3. Lave os oócitos várias vezes em um tubo Falcon de 50 ml com Solução Ringer para Oócitos sem Ca²⁺ até que a solução esteja suficientemente livre de resíduos teciduais.
4. Armazene os oócitos em Solução Ringer para Oócitos contendo Ca²⁺ (110 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂, 5 mM HEPES, pH 7,4) contendo gentamicina (50 μg/ml) a 18 °C.

6. Injeção de cRNA

1. Para expressão da Na⁺,K⁺- ou H⁺,K⁺-ATPase, injete os oócitos com 50 nl de solução de cRNA contendo 25 ng de cRNA do subunidade α e 5 ng de cRNA da subunidade β utilizando uma bomba de injeção Nanoject II acionada eletricamente (Drummond Scientific Inc.), com tubos de hematócrito de 3,5" (Drummond #3 000-203-G/X). CUIDADO: A quantidade de mRNA pode variar conforme a proteína-alvo e pode precisar ser ajustada para expressão máxima por meio de Western blot.
2. Para cada condição de fluxo (ex., em uma concentração específica de Rb⁺), injete 18-22 oócitos. Destes, 50% serão analisados sob condições "+fluxo" (ex., uma determinada concentração de Rb⁺), e 50% sob condições "-fluxo" (ex., com a concentração escolhida de Rb⁺ e um inibidor específico da enzima em concentração saturante, como 10 mM de ouabaína para Na⁺,K⁺-ATPase ou 10 μM de SCH28080 em pH 5,5 para H⁺,K⁺-ATPase).
3. Após a injeção, transfira os oócitos separadamente para placas de 96 poços preenchidas pela metade com Solução Ringer para Oócitos contendo Ca²⁺ e 50 μg/ml de gentamicina a 18 °C.
4. Cubra a placa de 96 poços com Parafilm para evitar evaporação excessiva.
5. Incube os oócitos por 2-7 dias (dependendo da proteína de interesse) a 18 °C. Se for necessário armazenar os oócitos por mais de 3 dias, recomenda-se trocar o meio de incubação nos micropoços a cada 3 dias.
6. Para cada conjunto de dados de fluxo (ex., um experimento de titulação de [Rb⁺]), cerca de 10 oócitos não injetados (ou injetados com 50 nl de água livre de nucleases) devem ser analisados sob condições "+fluxo" e "-fluxo". Assim, incube um número suficiente de células-controle da mesma maneira que os oócitos injetados com cRNA antes da análise de fluxo.

Pré-tratamento de oócitos que expressam ATPase heteróloga

Procedimento de carregamento com Na⁺

Para medições funcionais da Na⁺/K⁺-ATPase, é importante elevar a concentração intracelular de Na⁺¹³, conforme a seguir:

1. Transfira os ovócitos para o Na⁺ Loading Buffer (110 mM NaCl, 2,5 mM Na-citrato, 2,5 mM MOPS, 2,5 mM TRIS, pH 7,4) durante 45 min em gelo.
2. Para a recuperação subsequente, incube os ovócitos no Post Loading Buffer "PLB" (100 mM NaCl, 1 mM CaCl₂, 5 mM BaCl₂, 5 mM NiCl₂ e 2,5 mM MOPS, 2,5 mM TRIS, pH 7,4) por pelo menos 30 min em gelo.
3. Armazene os ovócitos em PLB em gelo até o uso.

7. Pré-bloqueio da Na⁺,K⁺-ATPase endógena

ATENÇÃO: Como os oócitos de Xenopus expressam uma Na⁺,K⁺-ATPase endógena, é importante bloquear essa bomba endógena antes dos experimentos de fluxo de Rb⁺, da seguinte forma:

1. Agora, bloqueie a Na⁺,K⁺-ATPase endógena incubando os ovócitos em Tampão Pós-Carregamento contendo 100 μM de ouabaína por 15 min à temperatura ambiente.

8. Eletrofisiologia

1. Prepare microeletrodos puxando capilares de borossilicato (GB150F-8P, Science Products GmbH) utilizando um puxador de micropipetas de dois estágios (Modelo PC-10, Narishige).
2. Encha os eletrodos de vidro pela extremidade posterior com KCl 3 M. Para experimentos de TEVC com H⁺,K⁺-ATPase, recomendamos o uso de NaCl 3 M em vez disso, o que resultou em gravações de corrente mais estáveis. Fixe a pipeta sobre o fio de Ag/AgCl dos suportes de microeletrodos do sistema de grampo de tensão por dois eletrodos.
3. Insira os microeletrodos de vidro e duas pontes de agar (que devem ser feitas com NaCl/agar em vez do tradicional KCl/agar), que conectam os eletrodos de referência de Ag/AgCl à solução do banho, na câmara de registro (Warner Instr., modelo RC-10) previamente preenchida com tampão de medição (por exemplo, PLB com ouabaína 10 μM para Na⁺,K⁺-ATPase).
4. Coloque o amplificador de grampo de tensão (Turbo TEC-10CX, NPI Electronics, Tamm, Alemanha) no modo "OFF".
5. Verifique separadamente a resistência de cada eletrodo de vidro (ambos devem estar na faixa de 0,5-2 MΩ).
6. Verifique os potenciais de offset dos eletrodos de tensão e de corrente na tela apropriada do amplificador TEVC. Em caso de desvio em relação ao zero, ajuste o offset com os reguladores de offset correspondentes do amplificador.
7. Coloque um ovócito no centro da câmara e penetre suavemente a membrana com os eletrodos de corrente e de tensão.
8. Verifique a leitura de potencial do amplificador. A leitura do potencial do eletrodo de tensão agora fornece o valor do potencial de repouso da célula.
9. Coloque o amplificador no modo VC (grampo de tensão).
10. Utilizando o software pCLAMP (Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA), fixe a célula em um potencial de membrana pré-definido. Este pode ser o valor do potencial de repouso previamente medido (para gravação sob condições de corrente de membrana nula) ou qualquer valor de potencial de teste desejado. Observe a amplitude e a estabilidade da corrente de vazamento (na ausência de K⁺/Rb⁺/Li⁺), que, como orientação geral, não deve exceder -200 nA em -30 mV.
11. Perfunda o ovócito por um determinado tempo (por exemplo, 3 min para Na⁺,K⁺-ATPase) com solução contendo Rb⁺ (para obter corrente máxima, use concentrações saturantes determinadas por medições de fluxo sob condições não fixadas) e registre a corrente da bomba com o software pCLAMP no modo de gravação contínua. Certifique-se de que a captação de Rb⁺ seja completamente interrompida posteriormente perfundindo a célula com solução livre de Rb⁺ por 30 segundos.
    1. Interrompa o experimento de grampo de tensão por dois eletrodos, remova o ovócito da câmara de registro e prossiga para a etapa de lavagem 4 do parágrafo "Experimentos de captação de Rb⁺" para analisar a captação de Rb⁺ por espectrofotometria de absorção atômica.
12. Realize a subtração da corrente de offset e avalie a integral temporal da corrente da bomba utilizando o programa Clampfit do pacote pCLAMP.

9. Medidas de Captação de Rb⁺

1. Corte e derreta a ponta amarela de uma pipeta em uma pipeta de 200 μl até um diâmetro de aproximadamente 2 mm. O uso dessas pontas garante transferência mínima de solução ao mover os ovócitos entre as placas de incubação ou lavagem. Aqueça brevemente a ponta com a chama de um isqueiro de bolso. Esta etapa de polimento evita danos aos ovócitos.
2. Prepare, para cada ovócito a ser medido, um tubo Eppendorf de 1,5 ml contendo 1 ml de água Millipore. Organize três placas de Petri com tampão de lavagem livre de Rb⁺ (ex. PLB) e uma com água Millipore.
3. Transfira simultaneamente cinco ovócitos pré-incubados para uma placa de Petri de 3,5 cm contendo tampão de fluxo de Rb⁺ (concentrações de 0 a 15 mM de Rb⁺) e incube por 3 min (Na⁺,K⁺-ATPase) ou 15 min (H⁺,K⁺-ATPase) sob controle de temperatura (ex. 21 °C em sala com ar condicionado ou sobre uma placa aquecedora).
4. Transfira simultaneamente os ovócitos para a primeira placa com tampão de lavagem livre de Rb⁺ (no caso da Na⁺,K⁺-ATPase, pode-se usar PLB). É obrigatório manter as variações entre os tempos de incubação menores que 5 s. Lave suavemente.
5. Transfira os ovócitos para a segunda e terceira placas com tampão de lavagem livre de Rb⁺, lavando suavemente.
6. Transfira os ovócitos para a placa com água Millipore, lavando suavemente.
7. Transfira cada ovócito individualmente para um dos tubos Eppendorf preparados contendo 1 ml de água Millipore.
8. Homogeneíze o ovócito pipetando para cima e para baixo com uma ponta de pipeta de 200 μl até que a solução fique turva de forma homogênea.

10. Preparação do AAnalyst 800 Utilizando o Sistema de Forno THGA

1. Ligue a válvula do gás inerte necessário (argônio) e insira uma lâmpada de cátodo oco apropriada (lâmpadas de elemento único para Li⁺ ou Rb⁺; Photron, Melbourne, Austrália) em uma posição arbitrária de soquete.
2. Inicie o software de controle WinLab32 (Perkin Elmer) e ligue a lâmpada de cátodo oco apropriada. As lâmpadas de cátodo oco Perkin Elmer Lumina são reconhecidas automaticamente e aparecem na lista de seleção. Lâmpadas de cátodo oco incompatíveis precisam ser inseridas manualmente.
3. Permita um tempo de aquecimento de aproximadamente 10 a 15 minutos para equilíbrio das lâmpadas.
4. Verifique visualmente se o tubo THGA (tubo de atomizador de grafite aquecido transversalmente, Perkin Elmer, #B3000641) está em boas condições. Os fornos THGA devem ser substituídos a cada 300 disparos (vida útil média indicada pelo fabricante), mas podem suportar um número maior de amostras.
5. Selecione a técnica de "forno THGA" no WinLab32.
6. Prepare pelo menos cinco amostras de calibração com concentrações de Rb⁺/Li⁺ entre 10 e 50 μg/L (ex., por diluição apropriada de uma solução de RbCl ou LiCl 1 M) e um branco contendo apenas água Millipore. Observação: os sais devem ser da maior pureza disponível ("puriss." ou provenientes de padrões comerciais de calibração para fins de AAS).
7. Escolha o arquivo de inicialização apropriado (denominado arquivo de "método", que fornece referência aos parâmetros de calibração e carrega as configurações do instrumento, ex., o comprimento de onda de detecção de AAS para Rb⁺ e Li⁺ é 780 nm e 670,8 nm, respectivamente), depois insira as posições e concentrações das amostras de calibração. Para tanto, selecione o autodoseador apropriado (placa de amostras com 88 ou 148 posições de amostragem para o equipamento AAnalyst 800).
8. Meça a curva de calibração.
9. Agora transfira cada homogeneizado de ovócito para copos de amostra individuais de polipropileno de 1,2 ml (Perkin Elmer, #B0510397) e coloque esses tubos de ensaio na bandeja do autodoseador.
10. Crie um arquivo de informações da amostra para identificar as amostras nas posições do autodoseador, ajuste o volume da amostra para 20 μl e inicie o instrumento.
11. Após a conclusão da análise (ou durante inspeção visual a cada hora, em séries longas de amostras), verifique as amostras em que a quantidade medida de Rb⁺ excede o valor máximo da curva de calibração. Nesse caso, dilua as amostras respectivas adequadamente e meça-as novamente.

11. Observações para a Medição de Grandes Números de Amostras (Acima de 50)

• Para uma operação noturna do instrumento, recomenda-se encher o reservatório do amostrador automático com água Millipore para evitar a evaporação dos homogeneizados nos tubos de ensaio.
• Recomenda-se colocar entre cada 20 amostras um tubo de ensaio com HNO₃ 2% para prevenir o entupimento da cápsula de injeção do amostrador automático.

Protocolo de temperatura recomendado para rubídio por THGA-AAS

Etapa	Temperatura (°C)	Tempo de Rampa (seg)	Tempo de Patamar (seg)	Fluxo de Gás Argônio (ml/min)
Secagem 1	110	1	20	250
Secagem 2	130	5	30	250
Pirolise	300-600	10	20	250
Atomização	1700-1800	0	5	0
Limpeza	2400	1	2	250

Protocolo de temperatura recomendado para lítio por THGA-AAS

Etapa	Temperatura (°C)	Tempo de Rampa (seg)	Tempo de Patamar (seg)	Fluxo de Gás Argônio (ml/min)
Secagem 1	110	1	30	250
Secagem 2	130	15	30	250
Pirólise	900	10	20	250
Atomização	2200	0	5	0
Limpeza	2450	1	3	250

Análise dos dados

1. Para cada condição de medição, calcule a captação média de Rb⁺. O espectrofotômetro de absorção atômica fornece valores em μg/L, os quais precisam ser convertidos em pmol/oócito/min.
2. Para análises cinéticas (valores aparentes de KM), subtraia a captação de fundo de Rb⁺ determinada a partir de oócitos-controle não injetados do mesmo lote, na concentração dada de RbCl.
3. Represente graficamente com o software Origin e aplique o ajuste de uma função de Hill ou de Michaelis-Menten aos dados. Nessas equações, [S] é a concentração de substrato, nH o coeficiente de Hill e K_0.5 a concentração de substrato necessária para ativação半máxima.

Resultados

A quantificação da captação de Rb⁺ por ATPases do tipo P que transportam K⁺ (ou Rb⁺) em contracorrente por meio de AAS no sistema de expressão de oócitos de Xenopus permite a determinação confiável dos parâmetros cinéticos da enzima.

Determinação da estequiometria de transporte da Na⁺/K⁺-ATPase

Para a Na⁺/K⁺-ATPase eletrogênica, os fluxos de Rb⁺ podem ser determinados em ex...

Discussão

O método descrito para medir a quantidade de Rb⁺ (ou Li⁺) absorvida em oócitos individuais de Xenopus que expressam Na⁺,K⁺- ou H⁺,K⁺-ATPase provou ser uma técnica versátil, flexível e precisa para determinar os parâmetros cinéticos ou termodinâmicos de transporte de ATPases do tipo P de contratransporte catiônico^1,4,5,7,8. É uma alternativa segura e confiável aos ensaios de fluxo de traçador radioativo e permite abordar um grande escopo...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
4.0 Material de sutura Ethicon Vicryl	Johnson Johnson	V633H
Colagenase tipo 1A de Clostridium hystolyticum	Sigma Aldrich	C9891
Kit de purificação de produto de PCR de alta pureza	Roche Applied Science	11732676001
Água livre de nuclease	Ambion	AM9937
mMessage mMachine Kit SP6/ T7	Ambion	1340, 1344
Ouabaína octahidratada	Sigma Aldrich	O3125
Tricain (sal de metanossulfonato de etilo 3-aminobenzoato)	Sigma Aldrich	A5040
Inibidor de tripsina tipo III-O de clara de ovo de galinha	Sigma Aldrich	T2011
SCH28080	Sigma Aldrich	S4443
AAnalyst 800	Perkin Elmer	0993-5256
WinLab32TM	Biofotômetro Perkin Elmer
	Eppendorf	6131 000.012
Capilares de Borosilicato	Produtos de Ciência	GB150F-8P
Tubos de hematócrito 3.5	Drummond Scientific	3 000-203-G/X
Lithium	Photron	P929LL
Lâmpada de cátodo oco Rubídio	Photron	P945
Extrator de micropipeta	Narishige	Modelo PC-10
Câmara de gravação de oócitos RC-10	Warner Instr.	W4 64-0306
Bomba de Injeção Nanoject II	Drummond Scientific	3-000-204
software pCLAMP	Molecular Devices
(1,2 ml)	Perkin Elmer	B0510397
Speedvac - Concentrador modelo 5301	Eppendorf	5301 000.210
THGA Tubo	Perkin Elmer	B3000641
Turbo TEC-10CX Amplificador	NPI Electronics	TEC-10CX

"Lâmpada de cátodo oco Copo de Amostra de Polipropileno