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Angiogênese no pulmão de rato Isquêmica

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DOI:

10.3791/50217

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8 de fevereiro de 2013

 , 
1Johns Hopkins Asthma and Allergy Center, Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Johns Hopkins University

Neste artigo

Resumo

O pulmão é perfundida, tanto arterial sistémica brônquica e artérias pulmonares. Na maioria das patologias do pulmão, é a mais pequena da vasculatura sistémica que mostra a neovascularização robusto. Cessação do fluxo sangüíneo pulmonar promove a angiogênese brônquica vivo. Nós fornecemos detalhes cirúrgicos de induzir isquemia da artéria pulmonar esquerda que promove neovascularização brônquica.

Resumo

O pulmão adulto é perfundido por tanto arterial sistémica brônquica e o retorno venoso inteiro que flui através das artérias pulmonares. Na maioria das patologias do pulmão, é a mais pequena da vasculatura sistémica que responde a uma necessidade de perfusão pulmonar melhorada e mostra neovascularização robusto. Isquemia vascular pulmonar induzida pela obstrução da artéria pulmonar demonstrou resultar na angiogénese arterial sistémica rápida no homem, bem como em vários modelos animais. Embora a avaliação histológica do curso de tempo da proliferação artéria bronquial em ratos foi cuidadosamente descrito por Weibel 1, os mecanismos responsáveis ​​para este crescimento organizado de novos vasos não são claras. Fornecemos detalhes cirúrgicos de induzir isquemia da artéria pulmonar esquerda no rato que conduz a neovascularização brônquica. A quantificação da extensão da angiogénese apresenta um desafio adicional, devido à presença dos dois leitos vasculares no interior do pulmão. Métodospara determinar a angiogénese funcional com base em injecções de microesferas marcadas são fornecidos.

Introdução

Angiogénese sistémica no pulmão é bem reconhecida. Em estados patológicos tais como a asma 2, fibrose pulmonar intersticial, 3, 4 cancro, e o tromboembolismo pulmonar crónica 5, a vasculatura e sistémico em torno das prolifera pulmonares e invade o parênquima pulmonar. No entanto, os modelos animais para estudar esta ativação diferencial da sistêmica e não a circulação pulmonar são poucos. Talvez o modelo mais reprodutível da neovascularização sistémica no pulmão do mamífero adulto é a que ocorre após a indução de isquemia da artéria pulmonar crónica. A resposta à obstrução da artéria pulmonar em humanos 5-7, cães 8, 9 porcos, ovelhas 10, 11 cobaias, ratos 1, 12, 13, 14 e ratos é a rápida proliferação da artéria brônquica, bem como as artérias intercostais. Os mecanismos responsáveis ​​por neovasculari sistémicazação do pulmão após isquemia pulmonar são amplamente desconhecido e não tenham sido amplamente estudadas. O curso de tempo da angiogénese brônquica em ratos após obstrução da artéria pulmonar esquerda foi cuidadosamente descrito no trabalho histológico de Weibel 1. Estendendo este trabalho, no rato, o nosso laboratório tem-se centrado em ambos os factores de crescimento importantes neste processo, assim como o resultado fisiológico desta neovasculatura no pulmão. Os resultados demonstram a quimiocina CXC CINC-3 é elevado precoce após isquemia e tratamento de ratos com um anticorpo neutralizante para CXCR2, o receptor para o CINC-3, atenua a angiogénese 13. A vasculatura recém-criada brônquica 14 dias após o início da isquemia pulmonar mostrou-se anormal com permeabilidade da proteína aumentou significativamente 15. Função pulmonar esquerda não foi normal, mostrando a diminuição da capacidade de difusão e uma diminuição do volume pulmonar 15. Embora a neovasculatura pode ter contributed para a preservação do tecido pulmonar durante a isquemia pulmonar crónica, isto não parece ser normal e pode contribuir para uma redução sustentada da função pulmonar.

Talvez um dos aspectos mais curiosos deste modelo refere-se a distribuição espacial da proliferação dos vasos sanguíneos. Apesar da liberação de fatores de crescimento dentro do parênquima pulmonar devido a isquemia, a neovascularização origina no montante relativamente grandes artérias brônquicas. A artéria brônquica normal surge como um pequeno ramo da aorta e invade a árvore da via aérea no carina. Assim, o mecanismo através do qual os factores de crescimento induzem a fase inicial da arteriogénese não é clara. Sugerimos que o rato, com uma anatomia vascular similar aos seres humanos, oferece uma oportunidade única de estudar os mecanismos responsáveis ​​pela angiogênese sistêmica durante a isquemia pulmonar. Apesar de obstrução completa da artéria pulmonar é uma ocorrência rara em seres humanos,aumento da vascularização brônquica parece ser igualmente induzidos em pacientes seja qual for o local e tamanho de obstrução da artéria pulmonar 16. Assim, fornecem uma descrição detalhada da abordagem cirúrgica para ligar a artéria pulmonar esquerda em ratos e um meio para quantificar a magnitude da angiogénese.

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Protocolo

Todos os protocolos realizados com ratos foram aprovados pelo Animal Care Universidade Johns Hopkins e do Comitê utilização e de acordo com as diretrizes do NIH. Sempre que possível, o animal deve ser cirurgicamente preparado numa zona separada da zona cirúrgica para minimizar a contaminação do local da cirurgia.

1. Anestesia / analgesia

  1. Rat lugar (ratos Sprague Dawley machos, 125-150 g; Harlan, Indianapolis, IN), numa câmara de indução infundida com 3% de isoflurano.
  2. Coloque rato anestesiado a bordo cirurgia anexado ao cone do nariz e ventilador com 3% de anestésico isoflurano. Use a técnica estéril para todos os procedimentos. Drapejar rato para assegurar campo operacional estéril.

2. Intubação

  1. Imobilizar apêndices em posição supina, utilizando fita cirúrgica.
  2. Remover rato de cone do nariz, estender a língua com uma pinça acolchoados.
  3. Use 14 intracath bitola com Stilet de metal despontava como guia. Deslize para trás parangue, em traqueia.
  4. Remover Stilet metálica deixando intracath plástico branco na traqueia. Verifique se o rato está respirando e ar flui através do tubo.
  5. Substitua cone do nariz com adaptador direto ao cateter, ligue rato ao ventilador (90 respirações / min; 8 de volume ml / kg de maré; Rodent Ventilator modelo 683, Harvard Apparatus, Holliston, Massachusetts).
  6. Aplicar Puralube (Butler Schein, Dublin, OH) pomada veterinária nos olhos.

3. Toracotomia

  1. Coloque o lado direito do rato para baixo, imobilizar apêndices com fita cirúrgica.
  2. Shave área costelas do lado esquerdo.
  3. Remover excesso de pele com pó pequeno.
  4. Faça campo estéril, limpando-se com álcool seguido de iodo-povidona vareta com tampão (Dynarex Corporation, Orangebur, NY). Repetir este processo mais duas vezes (para um total de três esfrega).
  5. Faça incisão transversal com tesoura estéril dissecando ou estéreis bisturi no centro de campo.
  6. Blunt dissecar através layers de tecido e gordura para baixo para costelas (última camada é fina membrana que cobre as costelas).
  7. Conte reforços para determinar 3 º espaço intercostal.
  8. Usando estéreis 45 ° Graefe fórceps, fazer incisão brusco entre o 3 º e 4 ª costela.
  9. Inserir separadores de costela, puxe-a delicadamente criando vazio aberto com visualização completa do pulmão, fita lugar em suturas para manter aberta.

4. Ligadura da artéria pulmonar esquerda

  1. Com 90 ° fórceps Graefe, mover pulmão esquerdo para trás com a mão direita.
  2. Usando o padrão Dumont # 5 fórceps retas, pegue artéria pulmonar esquerda e vias aéreas com a mão esquerda. Artéria pulmonar esquerdo deitou em cima de vias aéreas. Certifique-se de que o fórceps são directamente perpendicular à mesa. Além disso, é mais eficaz para pegar a artéria pulmonar esquerda / brônquio principal esquerdo na posição mais distal (mais próxima de parênquima). Empurre o pulmão esquerdo de ventilação de lado com esta manobra mão esquerda.
  3. Use Dumontpadrão # 5 45 ° fórceps curvos para separar a artéria pulmonar esquerda do brônquio principal esquerdo nas suas fronteiras naturais. Esta linha de separação parece fina e branca entre as duas estruturas individuais.
  4. Separar diretamente sob artéria, sem passar pelo navio; suavemente deslizar as pontas fórceps mantidos juntos ao longo da separação.
  5. Continue até dicas de pinças visivelmente separados da artéria pulmonar esquerda e brônquio principal esquerdo. Apenas um ponto pequeno de ponta precisa estar totalmente completamente. Se o sangue pode ser visualizado na ponta da pinça, então não é na sua totalidade através de ligação e não deve ser tentada. Depois de atravessar o espaço, a artéria pulmonar esquerda vai colocar na curva do fórceps. Segure nesta posição.
  6. Gentilmente liberar reta brusco aperto fórceps (mão esquerda) e pegue um pedaço de fio de pré-corte (~ 2-3 polegadas, tamanho polipropileno sutura 6-0; Myco médicos, Cary, NC).
  7. Abra fórceps curvos embalam artéria pulmonar esquerda e gsutura rab. Puxe suavemente sutura através do espaço entre a artéria pulmonar esquerda e brônquio principal esquerdo em um movimento ascendente em relação à curva do fórceps.
  8. Amarrar ocluindo o pulmonar esquerda com um nó quadrado, restante cuidadosamente recorte de sutura.
  9. Nervuras estreitas, utilizando fórceps rombas para segurar costela e duas vezes com sutura de polipropileno (monofilamento azul) 4-0 ligado ao tamanho de 19 mm, 3/8 reversa círculo agulha cortante (Myco Medical, Cary, NC) em uma pinça hemostática, tomando cuidado para não sutura da pele (apenas costelas).
  10. Completar um nó frouxo quadrado, encha o pulmão, o lugar da pressão expiratória final positiva (PEEP; 2-5 cmH 2 O), hyperinflate nó de pulmão, então segura firmemente, e fazer outro nó completo antes snipping restante da sutura. Remover da PEEP e visualizar durante 30 segundos para garantir que o pulmão não se desmorone. Aplicar 5 gotas Bupivicaine (APP Pharmaceuticals, Schaumbur, IL).
  11. Fechar pele colocando cola de tecido sobre a ferida e empurre a pele em conjunto, utilizando de volta end aplicador de ponta de algodão. Dar Bupivicaine (2,0 mg / kg por via subcutânea) no local da incisão posteriormente a cada 8 horas, durante 24 horas ou até que o animal retoma a actividade normal. À medida que a camada subcutânea nesta área é muito fina, não é fácil de suturar por conta própria. Quando a cola de tecidos é aplicado à pele e é pressionado em conjunto também encerra a camada subcutânea.
  12. Desligue o gás isoflurano, mas continuam a ventilar o rato por 1-2 minutos em ar ambiente até a volta de movimento voluntário. Desligue o tubo traqueal do ventilador e garantir que o rato está respirando espontaneamente, antes de removê-lo.
  13. Limpe Puralube de olhos com cotonete e movimento do monitor e recuperação. Injectar de cloridrato de buprenorfina (0,05 mg / kg por via intraperitoneal, Butler Schein, Dublin OH). Continuar a entrega de cada analgésico hr 12 para 48 horas após a cirurgia.

5. A canulação da artéria carótida esquerda

Para avaliar a magnitude dos brônquios perfusion do pulmão esquerdo isquémica em pontos de tempo desejado, após a ligação da artéria pulmonar esquerda, injectar microesferas marcadas através da artéria carótida esquerda no arco aórtico. Prepare ratos como acima 1-2.

  1. Corte na linha média ao longo do pescoço, Blunt dissecar a revelar traquéia e artéria carótida esquerda (local da injeção de microesferas).
  2. Inserção do cateter cheio de heparina ponta, solução salina sem corte de tubagem PE20 (Becton Dickinson, Sparks MD) para o vaso ligado à agulha de 25 g, de 4 vias torneira, uma seringa ml.
  3. Garrafa lugar de microesferas (15 um carmesim microesferas fluorescentes de poliestireno, 1 x 10 6 / ml esferas; Invitrogen, Eugene, OR) em água ultra-sons durante 30 seg.
  4. Remover vórtice garrafa, e elaborar 0,5 ml (500.000 microesferas) em um 1 ml de vidro seringa Hamilton (Hamilton Company, Reno, NV) através de uma agulha 20 g.
  5. Anexar seringa Hamilton para 4 vias torneira e infundir microesferas com seringa bomba (taxa: 500 ul / min; Genie Plus, Kent Scientific, Torringtem, CT).
  6. Remover Hamilton seringa e aparelho nivelado com 1 ml de solução salina heparized em 500 ul / min.
  7. Toracotomia peito cheio e desangrar o rato, cortando a veia cava inferior.
  8. Remover o pulmão esquerdo e de outros tecidos de interesse.
  9. Para extrair microesferas a partir de tecido, tomar todo o pulmão esquerdo do rato, após sangria e colocá-lo em KOH 2 M (4-6 ml). Coloque em um banho de água 55 ° C e deixe durante a noite para a digestão do tecido. Adicionar Tween 80 (0,25%), para lavar as pérolas, vortex (10 seg) e centrifugação (2.000 rpm, 20 ° C durante 10 min). Remover o sobrenadante, adicionar acetato de 2-etoxietilo (1 ml), vortex e deixar repousar durante 1 hora. Vortex a suspensão e centrifuga-se (2000 rpm, (20 ° C durante 10 min) Remover a camada de acetato de 2-etoxietilo aquosa contendo a fluorescência lugar, numa cuvete e medida utilizando um Hitachi F-2500 espectrofotómetro de fluorescência (excitação 618 612/emission. ; Digilab, Holliston, MA).

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Resultados

Fundido vascular: Resultados dos efeitos da isquemia da artéria pulmonar esquerda no rato são apresentadas na Figura 1. É mostrado um molde de metacrilato da vasculatura brônquica e da vascularização extensa da árvore da via aérea esquerdo 28 dias após LPAL. Para obter esse elenco, a vasculatura sistêmica foi injetado com uma mistura de metacrilato (vermelho), retrógrada para a aorta descendente ea traquéia foi canulada e injetada com um material de silicone branco baseado. Este molde vascular fornece u...

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Discussão

Ligação da artéria pulmonar esquerda em todas as espécies testadas conduz a neovascularização sistémica robusta do pulmão isquêmico. Nós apresentamos os detalhes da abordagem cirúrgica num modelo de rato. Nossos resultados produzidos por vazamento vascular, histopatologia e na rotulagem vivo demonstram que artérias brônquicas proliferar e perfundir o parênquima pulmonar. Assim, os mecanismos de angiogénese brônquica pode ser estudado num modelo animal que se assemelha à condição humana de tromboembolis...

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Divulgações

Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

Nós reconhecemos o trabalho do Dr. Adlah Sukkar, MD em ajudar com elenco do pulmão. Este trabalho foi financiado pelo NHLBI, HL088005.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Reagentes: Companhia
de cloridrato de buprenorfina, Puralube Butler Schein
bupivicaine APP Pharmaceuticals
Povidona-iodo vareta com tampão Dynarex Corporação
polipropileno tamanho sutura 6-0, 3/8 círculo agulha reversa corte Myco Médica
PE20 tubulação Becton Dickinson
15 um carmesim fluoroesferas de poliestireno Invitrogen
1 ml Hamilton seringa de vidro Hamilton Company
Equipamento:
Genie bomba de seringa Além Kent Científico
Espectrofotômetro de fluorescência Digilab
Roedor ventilador modelo 683 Harvard Apparatus
Tabela 1. Tabela de reagentes e equipamentos específicos.

Referências

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