Electrotaxis baseados em microfluídica para análise quantitativa On-demand de Caenorhabditis elegans 'Locomotion

Summary

Um método de micro-electro-fluídico semi-automatizado para induzir a demanda de locomoção em Caenorhabditis elegans É descrito. Este método baseia-se no fenómeno neurophysiologic de vermes respondem a campos eléctricos ligeiros ("electrotaxis") no interior de canais microfluidicos. Microfluidic electrotaxis serve como um baixo custo, e escalável técnica rápida, sensível, para triagem de fatores que afetam a saúde neuronal.

Abstract

Os nemátodo Caenorhabditis elegans é um organismo modelo versátil para a investigação biomédica devido à sua conservação dos genes e vias relacionadas com a doença, bem como a sua facilidade de cultivo. Vários C. elegans modelos da doença têm sido relatados, incluindo desordens neurodegenerativas tais como a doença de Parkinson (PD), que envolve a degeneração de dopaminérgica (DA) neurónios ^1. Ambos os transgenes e produtos químicos neurotóxicos têm sido utilizados para induzir a neurodegeneração promotor e consequentes defeitos de circulação em vermes, permitindo investigações sobre a base da neurodegeneração e telas para os genes e compostos neuroprotectores ^2,3.

Telas em eucariotos mais baixas, como C. elegans proporcionar um meio eficiente e econômico para identificar os compostos e os genes que afetam a sinalização neuronal. Telas convencionais normalmente são realizados manualmente e marcado por inspeção visual e, conseqüentemente, eles são tempo-consuming e propenso a erros humanos. Além disso, a maior enfoque na análise nível celular, ignorando a locomoção, que é um parâmetro muito importante para desordens de movimento.

Desenvolvemos um novo sistema de rastreio de microfluidos (Figura 1), que controla e quantifica C. locomoção elegans 'usando estímulos campo elétrico no interior de microcanais. Mostrámos que um campo de corrente contínua (DC) pode induzir robustamente on-demand locomoção para o cátodo ("electrotaxis") ^4. Invertendo a polaridade do campo faz com que o worm para reverter rapidamente a sua direção. Também mostrámos que os defeitos em neurónios sensoriais e outros dopaminérgicos alterar a resposta de natação ^5. Portanto, anormalidades na sinalização neuronal pode ser determinada utilizando a locomoção como uma leitura. A resposta de movimento podem ser quantificados com precisão, utilizando uma gama de parâmetros, tais como velocidade de natação, corpo frequência de flexão e do tempo de reversão.

4. Estes resultados levaram-nos a projetar um novo dispositivo micro para classificar passivamente vermes por idade e fenótipo ^6.

Também testamos a resposta de vermes para pulsado DC e alternada campos de corrente elétrica (AC). DC campos pulsados ​​de vários ciclos electrotaxis efetivamente gerados, tanto C. elegans e seu primo C. briggsae ^7. Numa outra experiência, os campos AC simétricas, com frequências que vão de 1 Hz a 3 kHz vermes imobilizada no interior do canal ^8.

Implementação do campo elétrico em um ambiente de microfluídica permite a execução rápida e automatizada do ensaio electrotaxis. Esta abordagem promete facilitar telas genéticas e químicas de alto rendimento para os fatoresafetando a função neuronal e viabilidade.

Protocol

1. Fotolitografia para Master Mold Fabricação

1. Banho de 3 cm da bolacha de silício em acetona durante 30 segundos e em seguida com metanol, durante 30 seg. Enxágüe com dH ₂ 0 água por 5 min.
2. Seque a superfície do wafer com uma pistola de ar N2. Aquece-se a bolacha em uma chapa quente a 140 ° C durante 2 min.
3. Plasma oxidar a superfície da bolacha de silício (1 min, 50 W).
4. A superfície da bolacha de spin-revestimento com 3 ml SU-8 100 fotossensível (40 seg; 1.750 rpm).
5. Pré-coze a pastilha revestida sobre uma placa quente a 65 ° C durante 10 min, depois rampa a temperatura até 95 ° C ao longo de 2 min. Manter essa configuração para uma 1 hora adicional.
6. Alinhar um photomask contendo o projeto do canal desejado. Expor a resistir a 550-600 mJ / cm ² de luz UV (350-400 nm). Máscaras podem ser projetados em AutoCAD e impresso em uma transparência com impressão de alta resolução.
7. Pós-cozer a bolacha sobre uma placa quente a 65 ° C durante 1 min e 95 ° C durante 10 min, rampa tele temperatura como antes.
8. Mergulhe o wafer em SU-8 solução reveladora por 10-15 min. Verifique para a conclusão do desenvolvimento de lavagem com isopropanol. Se um precipitado branco aparece, continuar a desenvolver. O molde mestre é mostrado na Figura 2A.

2. Litografia suave para Fabricação de microcanais

1. Misture 35 ml polidimetilsiloxano (PDMS), base de elastômero com 3,5 ml de agente de cura PDMS.
2. Coloque o molde mestre fabricado (padrão para cima) e uma pastilha de silício em branco em placas de Petri forradas com papel alumínio.
3. Verter 20 mL de pré-polímero de PDMS no prato molde mestre e 15 ml no segundo prato. Eliminar bolsões de ar sob os wafers pressionando suavemente sobre eles com um aplicador de madeira descartáveis.
4. Cubra ambos os pratos e reserve um dia para curar. Alternativamente, para a cura mais rápida, remover as bolhas de ar do PDMS usando um desgaseificador a vácuo e depois deixam-se os pratos em uma placa quente a 80 ° C durante 2hr.
5. Retire o papel alumínio e retire o PDMS das bolachas.
6. Utilizar a Harris Uni-Core (2,5 mm) para perfurar aberturas de acesso de fluidos em ambas as extremidades do canal. Corte o canal e branco PDMS em tiras de tamanho similar.
7. Carregar o canal, a tira de placa de PDMS e uma lâmina de vidro (75 x 25 mm ²⁾ no plasma de um oxidante, provavelmente localizado numa sala limpa. Expor a plasma de oxigênio por 40 segundos a 40 W de potência.
8. Furar a peça de canal e lâmina de vidro para os lados opostos da tira de placa. Retiradas para 2 horas para completar a ligação.
9. Coloque a montagem sobre uma placa quente a 120 ° C. Anexar tubos de plástico (diâmetro interno de 1/32 ", o diâmetro exterior de 3/32"), cada um, pelo menos, 6 cm de comprimento, com os reservatórios perfurados que utilizam pré-polímero de PDMS. Apor um conector de plástico fluídico para um ou ambos os tubos para permitir a ligação da seringa, ou utilizar acessórios disponíveis comercialmente.
10. Permitir que o PDMS proteger a tubulação para curar. Insira 3 "comprimentos de calibre 22 fio de cobre isolado em each reservatório, entre o tubo de entrada e o canal, e seguro, com pré-polímero de PDMS. O produto final é mostrado na Figura 2B.

3. Electrotaxis Experiment

1. Coloque a microcanais na fase (de preferência XY-móvel) de um microscópio com uma câmara montada ligada a um monitor (Figura 1).
2. Ligue a fonte de alimentação ou fios de saída do amplificador para os eletrodos do microcanais. Uma simples fonte de alimentação DC é suficiente que apenas um sinal de corrente contínua for desejado, mas de um amplificador conectado a um gerador de funções permite a aplicação de sinais AC e DC pulsada bem.
3. Aplica o tubo de saída do microcanal para uma seringa descartável. Imergir a boca do tubo de entrada em M9 tampão fisiológico e suavemente aspirar o líquido para dentro do canal por aplicação de uma pressão negativa no interior da seringa (quer manualmente ou utilizando uma bomba de seringa). Quando os tubos de entrada e de saída são ambas cheias com M9, desligar a seringa from o tubo. Nivelar os dois tubos para a mesma altura para impedir o fluxo de acionamento hidrostático.
4. Aplicar uma tensão de CC para o canal e garantir que a resistência (R = V / I) é de cerca de 0,6 mohms (para uma redução de 50 mm de comprimento, 0,3 milímetros de largura e -0,1 mm de profundidade microcanal).
5. Se estiver satisfeito com a integridade do canal, siga os passos acima para carregar os vermes de uma suspensão diluída para o canal.
6. Retirar a seringa e hidrostática manipular o fluxo ajustando altura relativa dos tubos. É este método para colocar um sem-fim no centro do canal e, em seguida, colocar ambos os tubos no mesmo plano de elevação.
7. Definir o fornecimento de energia para a tensão apropriada: 4-12 V / cm, para os animais fase L3, 4-10 V / cm, e para L4s 2-4 V / cm, para os adultos jovens. Ative o sinal elétrico e permitir que 1 min de pré-exposição para o worm para se aclimatar ao campo. O worm deve começar a se mover em direção ao cátodo. Quando o minuto passou, usar a câmera para começar a gravar.
8. Para AC e pulsoexperimentos d CC, o campo elétrico resposta máxima pode ser adotada a partir do ciclo do sinal acima e freqüência e duty pode ser modulada como desejado ^{7, 8.}
9. Quando o experimento for concluído, remova todo o líquido (e vermes) do canal, lave-o com dH ₂ 0, e deixar o dispositivo em uma placa quente a 125 ° C para secar.
10. Extrair dados locomotores de vídeos gravados manualmente usando NIH ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) ou software de monitoramento verme baseada em MATLAB personalizado.

Results

Um vídeo representante electrotaxis um nematóide adulto jovem do tipo selvagem e sua posição e saídas de velocidade a partir do software de rastreamento verme são mostrados na Suplementar Video 1 e Figura 3. O próprio software de análise de movimento não reconhece a direção da polaridade do campo eo tempo de inversão de polaridade, mas sim, esta informação deve ser obtido a partir da fonte de vídeo. Isso pode ser feito usando um taco de áudio ou visual no vídeo ou escrevendo as condiçõe...

Discussion

Aproveitando-se do fenômeno comportamental descrita pela primeira vez por Gabel e colegas e com base no trabalho de manipulação dieletroforética de Chuang e colegas ^11,12, nosso ensaio electrotaxis baseado em microfluídica fornece um método fácil, robusto e sensível para investigar a atividade neuronal em vermes usando o movimento como uma saída. A análise dos parâmetros de movimento permite a comparação quantitativa entre os diferentes genótipos. A precisão de fabrico de microcanais e aplicação de campo eléc...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetona	CALEDON Labs	1200-1-30
Metanol	CALEDON Labs	6700-1-30
Isopropanol	CALEDON Labs	8600-1-40
SU-8	Microchem Corp.	Y131273	SU-8 100
SU-8 Desenvolvedor	Microchem Corp.
92x16mm Placa de Petri	Sarstedt	82.1473.001
Sylgard 184 Kit de Elastômero	de Silicone Dow Corning		Contém base de elastômero e agente de cura
Gerador de função Tektronix	Inc.		Amplificador Modelo AFG3022B
Trek	Inc.		Modelo 2210-CE
Bomba de seringa	Harvard Apparatus	70-4506	Modelo 11 ELITE
Placa de aquecimento	Fisher Scientific	11675916Q	Modelo HP131725Q