Preparação de lipossomas gigantes por Imagem e patch-clamp Eletrofisiologia

Resumo

Reconstituindo as proteínas da membrana funcionais em lipossomas gigantes de composição definida é uma abordagem poderosa quando combinado com eletrofisiologia patch-clamp. No entanto, a produção de lipossomas gigante convencional pode ser incompatível com a estabilidade da proteína. Descrevemos protocolos para a produção de lipossomas gigantes de lípidos puros ou de pequenos lipossomas contendo canais de iões.

Resumo

A reconstituição de canais de iões em membranas de lípidos quimicamente definidos para a gravação electrofisiológico tem sido uma técnica poderosa para identificar e explorar a função destas proteínas importantes. No entanto, as preparações clássicas, tais como bicamadas planares, limitar as manipulações e experiências que podem ser realizadas sobre o canal reconstituída e seu ambiente de membrana. A estrutura mais células como de lipossomas gigantes permite experimentos de patch-clamp tradicionais, sem sacrificar o controle do ambiente lipídico.

Eletropolimerização é um meio eficiente para a produção de lipossomas gigantes> 10 m de diâmetro, que se baseia na aplicação de tensão alternada a um filme lipídico fina, ordenado depositado sobre uma superfície do eletrodo. No entanto, uma vez que o protocolo clássico chama para os lipidos a ser depositados a partir de solventes orgânicos, que não é compatível com as proteínas de membrana menos robustas como canais iónicos e devem ser modificadas. Recentemente, protocols têm sido desenvolvidos para electroform lipossomas gigantes parcialmente desidratadas de lipossomas pequenos, que se adaptaram aos lipossomas contendo proteína no nosso laboratório.

Apresentamos aqui a fundo, equipamentos, técnicas e armadilhas da eletropolimerização de lipossomas gigantes de pequenas dispersões de lipossomas. Começamos com o protocolo clássico, que deve ser dominado antes de tentar os protocolos mais difíceis que se seguem. Demonstramos o processo de desidratação parcial controlada de pequenos lipossomas utilizando o equilíbrio do vapor com as soluções salinas saturadas. Finalmente, demonstramos o próprio processo de eletroformação. Iremos descrever equipamentos, simples e barato, que pode ser feita em casa para produzir lipossomas de alta qualidade, e descrevem a inspecção visual da preparação, em cada fase para assegurar os melhores resultados.

Introdução

Lipossomas gigantes (muitas vezes chamado de vesículas unilamelares gigantes, ou GUVs) foram principalmente usados ​​para estudar a física ea química física de bicamadas lipídicas, incluindo estudos de deformação bicamada, a convivência fase lateral ("jangadas"), a fusão da membrana, etc ^1-4. Eles têm uma estrutura de célula grosseira, como: concha esférica de membrana que envolve um interior aquoso, que pode ser feita facilmente diferente do tampão aquoso circundante. Eles são, por definição, ≈ 1-100 um de diâmetro, de forma que possam ser visualizados utilizando uma variedade de abordagens de microscopia de luz. Elas podem ser feitas usando tenso gradientes osmóticos ou tensão aplicadas mecanicamente, de modo que, embora geralmente macia, as suas propriedades podem ser manipuladas para um manuseamento fácil. Em particular, controlando a "dureza" do lipossoma torna mais simples para formar manchas "lipossoma inscritos" ou excisada para electrofisiologia. No passado, a reconstituição do canal iónico foi amplamente praticada em planar lípido bilayers. Agora, a capacidade para formar manchas de lipossomas gigantes e usar o tremor considerável de ferramentas desenvolvidas para electrofisiologia convencional (microscopia de fluorescência, micropipeta aspiração, perfusão rápida e controlo de temperatura, etc), faz com que os lipossomas gigantes cada vez mais atraente para os estudos de reconstituição ^5,6.

Lipossomas gigantes tenham sido feitas por muitas estratégias. Na verdade, os lipossomas formam-se espontaneamente gigantes por um processo de inchamento quando um filme de lípido seco é reidratado ^4,7,8. O desejo de preparar mais rapidamente maior, lipossomas mais uniformes levou os pesquisadores a outras abordagens, o principal deles eletropolimerização ^1,9. Eletroformação também depende da hidratação de uma película de lípido seca, mas acelera o processo através da aplicação de um campo eléctrico oscilante do outro lado da película de lípido. O campo é aplicada através de dois eletrodos, tanto fios de platina ou de índio-estanho-Oxide (ITO) lâminas de vidro revestidas, separados por água outamponar e sobre o qual são depositados os lípidos. Ao acelerar o inchaço dos lipossomas, se consegue um maior rendimento de lipossomas maiores. Assim, eletropolimerização tornou-se o método padrão para a produção de lipossomas gigantes ^4.

O mecanismo de eletropolimerização não é totalmente compreendida, e a maioria dos protocolos são desenvolvidos empiricamente (por exemplo, ^10,11). No entanto, podemos aprender um pouco sobre o que esperar, considerando a teoria e alguns resultados empíricos. Acredita-se que eletropolimerização ocorre por condução fluxo eletro-osmótico de tampão entre bicamadas lipídicas individuais empilhados no filme lipídico depositado ^10,11. Acoplamento electrostático a flutuações térmicas das bicamadas lipídicas é também provavelmente envolvidos ^12. Estas hipóteses qualitativamente prever os limites superiores para a frequência e a força do campo eléctrico que pode ser usado ^10,12. Em particular, prevê-se que as soluções de elevada condutividade ( ou seja, soluções fisiológicas sal) reduzir as forças eletro que podem iniciar a eletropolimerização lipossomas ^12. Vazões eletroosmótico geralmente diminuem com o aumento da concentração de sal e são frequentemente culminado em alguma freqüência de oscilação do campo elétrico (por exemplo, embora em uma geometria diferente, Green et al. ^13). Assim, maiores intensidades de campo e freqüências mais altas são razoáveis ​​para soluções de alta condutividade, dentro dos limites de ^10.

No entanto, as proteínas de membrana são susceptíveis de ser incompatível com o método usual de lípidos para depositar eléctrodos electroswelling para o procedimento, isto é, em solventes orgânicos, os quais são, em seguida, evapora-se para deixar uma fina película de lípido. Existem dois caminhos principais contornar esta dificuldade: a incorporar proteínas após a formação de lipossomas gigante, ou para adaptar a forma como os lípidos sejam depositados. Nossa abordagem baseia-se em outros ^5,11 para depositar os lipídios e reconstituiçãotuído proteína de membrana juntos a partir de uma suspensão de pequenas ou grandes "proteolipossomos". Nós descrevemos o processo demorado e mais difícil de produzir proteolipossomos de proteína e lipídios purificada em outro lugar (Collins e Gordon, em revisão). Aqui descrevemos o protocolo, na ausência de qualquer proteína, mas é o mesmo quando a proteína é incorporada, que incluem os resultados que mostram que proteolipossomas contendo o canal de TRPV1 de iões pode ser transformado em GUVs e usado para de patch-clamp electrofisiologia. Em qualquer abordagem eletropolimerização, a inspeção visual da amostra de lipídios durante o processo de deposição de lipídios é fundamental para o sucesso.

Nossa abordagem pode ser relevante para além da aplicação especializada para canal de reconstituição de íons. No momento, uma vez que este protocolo desenvolvido pela primeira vez e, agora, tem sido também demonstrado como a maneira em que os lípidos são depositadas sobre os eléctrodos para eletroformação afecta a heterogeneidade da composição dos GUVs resultantes. Baykai-Caglar et al. mostrou que ¹⁴ GUVs formados a partir de lipossomas cuidadosamente desidratados apresentou uma menor variação de 2,5 vezes na temperatura de transição de miscibilidade GUVs formados a partir de misturas de diferentes fosfolipidos e colesterol. O trabalho indica que os lípidos, e especialmente o colesterol, pode precipitar a partir da mistura de lípidos, quando depositados a partir de solventes orgânicos, o que resulta em grande variação espacial da composição do filme de lípidos depositado. Isto é especialmente importante para os estudos de comportamento de fase da membrana lipídica, mas também pode ser crucial para as experiências quantitativas na função do canal iónico. Protocolo Baykal-Caglar et al 's. É semelhante, mas não idêntico ao nosso, e os leitores são encorajados a estudar também.

Este protocolo (ver descrição, a Figura 1) é uma das muitas que poderiam ser usadas. Em princípio, o sucesso da eletroformação depende da mistura de lípidos, a hidratação, a temperatura, outros solutos (principalmente iões), e deClaro que a tensão ea frequência usada em formação. Como eletropolimerização torna-se melhor compreendida, esperamos aperfeiçoar nosso protocolo mais.

Finalmente, muitas vezes há uma curva de aprendizagem em galvanoplastia lipossomas gigantes. Sugerimos dominar o protocolo convencional (Seções 1 e 4, e, se necessário, Seção 5) antes de aprender a depositar lipídios a partir de suspensões de lipossomas (seções 2-5).

Protocolo

1. Deposição de lipídios a partir de solventes orgânicos: Protocolo Classical

1. Remover os lípidos de armazenamento à temperatura de -20 ° C ou -80 ° C, aquecer até à TA Cuidado:. Lípidos são extremamente higroscópico, e muitos são sensíveis ao oxigénio. Cobertura de lípidos em árgon seco ou azoto gasoso e em todos os passos para minimizar a exposição ao ar.
2. Se necessário, suspender os lipídios em clorofórmio ou ciclo-hexano em mg / ml 1-10, nota que as concentrações indicadas pelo fabricante são tipicamente nominal só CUIDADO: Use luvas apropriadas e outros equipamentos de proteção individual, quando a utilização de solventes orgânicos.. Retire o PPE rapidamente se solvente é derramado sobre eles, como a maioria dos materiais ainda são permeáveis ​​a estes solventes e eles só fornecem protecção temporária.
3. Limpe ambos os lados de duas 25 x 37.5 mm ITO lâminas de vidro revestidas com etanol
4. Misturar os lípidos para alcançar as proporções molares desejadas. Por cada 1 ^cm2 de área de ITO desliza para ser revestido com lábioid, mix ~ 15-20 mg de lipídios. Por exemplo, se os dois 25 x 37.5 mm lâminas eram para ser totalmente revestido, teríamos tipicamente usam 30 ul de 10 mg / ml de mistura de lípidos Nota:. Adicionar 0,1% em mol de DPPE-vermelho do Texas para imagiologia fluorescente, e ver abaixo para cuidados cerca corantes fluorescentes.
5. Verifique se ITO lado revestido das lâminas de vidro está voltada para cima, medindo a resistência da superfície com um ohmímetro ou multímetro.
6. Aspirar os lipídios em um solvente resistente à seringa Cuidado:. Há colas ou plástico, excepto PTFE, deve contactar o solvente orgânico.
7. Com a agulha da seringa não é bem tocando a superfície de ITO, aplicam-se lentamente os lipídios se movendo a agulha para trás e para a frente através do slide. Cubra a superfície o mais uniformemente, procura um "arco-íris brilho" na superfície do vidro.
8. Coloque os slides rapidamente sob <1 Torr (1 mm Hg) de vácuo para 0,5-1 horas para remover qualquer traço do solvente. Solte a vácuo com gás inerte.
9. Aplicar uma junta de vedação de silicone, com umfina camada de gordura de silicone vácuo em ambos os lados. Adicione pelo menos 5 mm de corrediça descoberta exposta a uma extremidade da lâmina.
10. Proceder de imediato à Secção 4.

2. Preparação de lipossomas pequeno para desidratação controlada

1. Preparar a mistura de lípidos como nos Passos 1.1 a 1.4.
2. Secar os lípidos utilizando uma corrente de gon ou azoto gasoso num tubo de cultura de 10-15 mm de diâmetro. No caso de pequenas quantidades de lípidos, ≤ 0,5 mg, o filme resultante pode ser hidratado imediatamente após a sua colocação sob vácuo durante 0,5-1 horas para remover o solvente residual, prosseguir para o passo 2.5. Grandes quantidades de lipídios tendem a prender solventes orgânicos em um gel grosso, mesmo sob vácuo, e estão melhor preparados por liofilização, veja os passos 2.3-4.
3. Suspender o filme de lípido seco em ciclo-hexano, cobrir-se com árgon e de vedação com uma tampa, colocar o tubo num bloco frio e congelamento a -80 ° C durante um mínimo de horas.
4. Coloque o bloco da amostra fria e lípido num sistema de vácuocapaz de atingir 100 mTorr. Aplique vácuo, que vai "parar" em cerca de 1 Torr como sublima solventes fora. Uma vez que o solvente é completamente removido (~ 1 h) de vácuo irá cair abaixo deste nível. Libertação de vácuo com o gás inerte e selar o tubo ou hidrato imediatamente.
5. Enquanto os lípidos estão sob vácuo, o buffer de hidratação desgaseificar usando vácuo e aspersão de ^15-17.
6. Hidratos dos lípidos utilizando tampão desgaseificado a concentração final de 1-10 mg / ml. Permitir que os lípidos para hidratar lentamente. Depois de 30 min-1 hora e vortex para quebrar pedaços restantes. Espera um 0,5-1 horas adicionais para permitir a hidratação completa. Usar um osmoticant, tal como sorbitol ou sacarose até 200 mm, para evitar a desidratação completa nos passos seguintes.
7. Prepara lipossomas 100-200 nm de diâmetro por extrusão. Veja protocolo extrusão do fabricante para obter mais detalhes. Note-se que o buffer deve ter menos de ~ 25 mM força iônica, ou protocolos especiais de tensão eletropolimerização serão necessários na seção 4.

3.Deposição de Lipídeos por desidratação controlada de pequenas Lipossomas

1. Atenção: Este protocolo requer lípidos para ser colocado em equilíbrio com vapor de soluções salinas saturadas durante muitas horas. Recomendamos realizar o protocolo em uma atmosfera de gás inerte, usando uma caixa de luva ou gabinete similar.
2. Cuidado: Se preparando amostras contendo proteínas, evitar a desidratação completa. Hidratar a atmosfera em qualquer recinto com um copo de água morna, ou um umidificador base de ultra-sons. Usar um higrómetro para garantir que há, pelo menos, 30% de humidade relativa. Use sorbitol ou sacarose na pequena tampão lipossoma como precaução adicional para evitar a desidratação total.
3. Prepare uma solução saturada de umidade relativa do ar apropriada sal. Humidade alvo depende da osmolaridade da preparação das vesículas. No caso das preparações com osmolaridade fisiológica, utilizar 30-45% de HR, enquanto que as preparações de vesículas de baixa osmolaridade pode ser desidratado adequadamenteequilíbrio com 75-90% RH (Ver também Tabela 1).
4. Coloque a solução saturada de sal e excesso de sal em um recipiente hermeticamente selado com uma prateleira interior. Embalagens de alimentos comerciais para iogurte e granola funciona muito bem. Substitua a prateleira após o enchimento, e certifique-se de líquidos é 5-10 mm abaixo da prateleira.
5. Limpe ITO lâminas revestidas como na seção 1. Usar o multímetro para determinar qual dos lados está condutor, e rotular o lado não-condutora com o nome da amostra.
6. Levemente graxa ambos os lados do silicone (Grau USP VI) junta (s) com um ou vários furos.
7. Coloque o lado lâminas condutoras em cima da bancada, e aplicar a junta de silicone (s) em cada lâmina para que lípido será aplicada, tornando-se que há pelo menos 5 mm de lâmina exposta numa extremidade para ligar ao aparelho eletroformação. Alise a junta para assegurar uma boa vedação.
8. Dilui-se a preparação das vesículas num tampão de baixo teor de sal isosmótica de ~ 1-2 mg / ml. Nós achamos que a maior concentrções produzir maus resultados.
9. Aplicar lipídico para o slide em gotas ul de 1-10. Pequenas gotas geralmente produzem melhores resultados.
10. Colocar a lâmina no interior de prateleira acima da solução salina saturada e selar o recipiente hermeticamente. Deixe em temperatura ambiente por 3 horas para O / N. O recipiente pode ser colocado a 4 ° C, mas nota que, para alguns sais, a HR depende fortemente da temperatura e, em que o frio vai aumentar o tempo de equilíbrio.
11. O filme resultante pode ter um ligeiro brilho arco-íris para isso, mas em qualquer caso, devem aparecer quase desidratado. Soluções a partir altamente osmóticos pode ser impossível para secar completamente a um filme lipídico, o que não irá afectar negativamente os resultados.

4. Eletropolimerização de lipossomas gigantes

1. Películas lipídicas, em especial as formadas a partir de lipossomas desidratados, são facilmente desalojado. Hidrato cuidadosamente cada poço pela colocação de uma agulha G 27, a seringa na borda do anel de vedação e aplicando lentamente tampão. Buffers podemincluem água, ≤ 200 mM sacarose, ≤ 1 M sorbitol e ≤ 5 HEPES. Solução salina mais de 10 mm podem exigir protocolos de tensão eletropolimerização alternados. Transbordamento cada junta assim por ~ 10%.
2. Nota: uma vez que os lipídios são hidratados, avançar rapidamente através das etapas restantes, desde filmes lipídicos começar a descamar imediatamente. Rendimento e tamanho são maximizados se eletropolimerização começa pontualmente.
3. Com um movimento suave, aplicar uma segunda corrediça de ITO, cara condutora no interior, para a parte superior da junta. Certifique-se de ter pelo menos 5 mm de saliência fora da área de vedação e em frente à primeira saliência. Pressione suavemente para assegurar uma boa vedação.
4. Limpe as duas saliências usando etanol e verificar que os lados que enfrentam a junta são condutoras com o multímetro.
5. A câmara pode ainda ser protegido com parafilme luz ou grampos de mola de tensão, se o desejar.
6. Ligação da câmara eletroformação a uma fonte de tensão, assegurando barras de alumínio ou de cobre, "EMI gasket espuma ", ou fita adesiva condutora às superfícies condutoras das duas lâminas. Usamos EMI junta de espuma. Planos para um gabarito e fixação são mostrados na Figura 5.
7. Verifique se não há curto-circuito entre os contatos, e que os contatos se conectar corretamente às superfícies de ITO, usando o multímetro.
8. Aquece-se a câmara de 10 ° C acima da temperatura de fusão mais elevada de qualquer um dos lípidos presentes, por exemplo, para o DPPC, o calor a 52 ° C, mínimo, 10 ° C acima da temperatura de fusão da cadeia de 42 ° C.
9. Para buffers com pouco sal, aplique uma onda senoidal de 10 Hz, ~ 0,7 V _rms para cada milímetro de diferença entre as duas superfícies revestidas ITO, por 60-90 min. Para buffers elevados de sal, outros protocolos de tensão deve ser utilizado (ver referências).

5. Imaging and Troubleshooting

1. Imagem do lipossoma utilizando um microscópio invertido equipado com um cubo de filtro para rodamina ou corantes Texas Red. O lipossoma deve ser de forma esférica,predominantemente unilamelar por olho, e livre de defeitos, tais como "strings" pendurado do lipossoma.
2. Se os lipossomas forem demasiado pequenas, usar menos lípido.
3. Se existem muitos defeitos ou alguns lipossomas, isto pode ser devido a lípidos em fase de gel. Considerar o aumento da temperatura eletropolimerização.
4. Se alguns ou nenhum lipossomas gigantes formada em tudo de pequenos lipossomas desidratados, reduzir a resistência osmótica do tampão de lipossoma, ou aumentar a resistência osmótica do tampão eletroformação. Um influxo de tampão para a solução concentrada de tampão intersticial pode provocar a delaminação da película de lípido depositado.
5. Se o rendimento da vesícula, qualidade ou tamanho é pobre, e você incluiu sais ou tampões de pH nos buffers eletropolimerização ou lipossomas, considere protocolos alternativos de tensão eletropolimerização. Por exemplo, Pott, et ai. ^11, recomendado um protocolo de três passos utilizando uma onda sinusoidal de 500 Hz, o aumento da tensão de 50-1,300 Vpp / h durante 30 minutos, mantendo durante 90 minutos, on diminuindo a frequência de 50 Hz em 30-60 min. Eléctrodos de platina ou de titânio pode ser necessário neste caso, mas isso não irá alterar substancialmente o protocolo.

Resultados

Nos nossos exemplos, podemos preparar lipossomas a partir de uma mistura de cerca de 55 mol% de POPC (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-fosfocolina), 15% molar POPS (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-fosfo , 30 mol% de colesterol e 0,1% molar de Texas Red-rotulado 1,2-dipalmitoil-sn-fosfoetanolamina (TxR-DPPE). Esta composição foi escolhida como representante de aproximadamente lípidos do gânglio da raiz dorsal ^18. Notamos que 15% em mol carregada lípido (aqui POP) está perto do limite ...

Discussão

Eletropolimerização de lipossomas gigantes tornou-se uma técnica flexível compatível com diversos lipídios, preparações, e tampões. O controle cuidadoso do processo de deposição de lipídios é o mais crítico para o sucesso. Nós apresentamos ferramentas simples para fazer a deposição controlada de lipídios a partir de pequenas preparações de lipossomas um processo simples. A humidade relativa é crítico para o bom desidratação dos lipossomas iniciais, e o valor óptimo variará com a concentração inicial dos solutos na suspe...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Multímetro digital	Agilent Technologies, www.agilent.com	U1232A ou similar	Qualquer multímetro serve, mas evite ohmímetros analógicos de estilo antigo que aplicam muito mais corrente à resistência em teste.
	Fluke	117 ou 177	Qualquer multímetro serve, mas evite ohmímetros analógicos antigos que aplicam muito mais corrente à resistência em teste.
Gerador de funções	Agilent Technologies, www.agilent.com	33210A ou similar	A maioria dos geradores de funções funciona para protocolos simples. Este modelo programável é útil para protocolos avançados de eletroformação. Certifique-se de que o gerador pode conduzir 10 V pico a pico em um 50 Ω carregar
lâminas de vidro revestidas com ITO	Delta Technologies, Loveland, CO www.delta-technologies.com	CB-90IN-S107 ou similar	Quebre-as ao meio para fazer duas lâminas, 25 mm x 37 mm
Controlador de temperatura	Omega Engineering Stamford, CT www.omega.com	CNi3233 ou similar
Higrômetro	Extech, Nashua, NH, www.extech.com	445815
Folha de borracha de silicone	McMaster-Carr Elmhurst, IL www.mcmaster.com	87315K64	Use silicone USP Grau VI para sua
junta EMI	Laird Technologies www.lairdtech.com	4202-PA-51H-01800 ou similar	Distribuído pela Mouser www.mouser.com
TxR-DHPE	Life Technologies, Carlsbad, CA www.lifetechnologies.comT1395MP		Outros lipídios marcados com fluorescência estão disponíveis, mas o TxR-DHPE é um dos mais brilhantes e fotoestáveis.
POPC	Avanti Lipídios Polares, Alabastro, AL www.avantilipids.com	850457P ou 850457C	Os lipídios podem ser encomendados como pós (P) ou em clorofórmio (C)
POPS	Avanti Polar Lipids	840034P/C
Colesterol	Sigma-Aldrich	C8667