Reconstituindo as proteínas da membrana funcionais em lipossomas gigantes de composição definida é uma abordagem poderosa quando combinado com eletrofisiologia patch-clamp. No entanto, a produção de lipossomas gigante convencional pode ser incompatível com a estabilidade da proteína. Descrevemos protocolos para a produção de lipossomas gigantes de lípidos puros ou de pequenos lipossomas contendo canais de iões.
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Artigo de método
Preparação de lipossomas gigantes por Imagem e patch-clamp Eletrofisiologia
Neste artigo
Resumo
Resumo
A reconstituição de canais de iões em membranas de lípidos quimicamente definidos para a gravação electrofisiológico tem sido uma técnica poderosa para identificar e explorar a função destas proteínas importantes. No entanto, as preparações clássicas, tais como bicamadas planares, limitar as manipulações e experiências que podem ser realizadas sobre o canal reconstituída e seu ambiente de membrana. A estrutura mais células como de lipossomas gigantes permite experimentos de patch-clamp tradicionais, sem sacrificar o controle do ambiente lipídico.
Eletropolimerização é um meio eficiente para a produção de lipossomas gigantes> 10 m de diâmetro, que se baseia na aplicação de tensão alternada a um filme lipídico fina, ordenado depositado sobre uma superfície do eletrodo. No entanto, uma vez que o protocolo clássico chama para os lipidos a ser depositados a partir de solventes orgânicos, que não é compatível com as proteínas de membrana menos robustas como canais iónicos e devem ser modificadas. Recentemente, protocols têm sido desenvolvidos para electroform lipossomas gigantes parcialmente desidratadas de lipossomas pequenos, que se adaptaram aos lipossomas contendo proteína no nosso laboratório.
Apresentamos aqui a fundo, equipamentos, técnicas e armadilhas da eletropolimerização de lipossomas gigantes de pequenas dispersões de lipossomas. Começamos com o protocolo clássico, que deve ser dominado antes de tentar os protocolos mais difíceis que se seguem. Demonstramos o processo de desidratação parcial controlada de pequenos lipossomas utilizando o equilíbrio do vapor com as soluções salinas saturadas. Finalmente, demonstramos o próprio processo de eletroformação. Iremos descrever equipamentos, simples e barato, que pode ser feita em casa para produzir lipossomas de alta qualidade, e descrevem a inspecção visual da preparação, em cada fase para assegurar os melhores resultados.
Introdução
Lipossomas gigantes (muitas vezes chamado de vesículas unilamelares gigantes, ou GUVs) foram principalmente usados para estudar a física ea química física de bicamadas lipídicas, incluindo estudos de deformação bicamada, a convivência fase lateral ("jangadas"), a fusão da membrana, etc 1-4. Eles têm uma estrutura de célula grosseira, como: concha esférica de membrana que envolve um interior aquoso, que pode ser feita facilmente diferente do tampão aquoso circundante. Eles são, por definição, ≈ 1-100 um de diâmetro, de forma que possam ser visualizados utilizando uma variedade de abordagens de microscopia de luz. Elas podem ser feitas usando tens....
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Protocolo
1. Deposição de lipídios a partir de solventes orgânicos: Protocolo Classical
- Remover os lípidos de armazenamento à temperatura de -20 ° C ou -80 ° C, aquecer até à TA Cuidado:. Lípidos são extremamente higroscópico, e muitos são sensíveis ao oxigénio. Cobertura de lípidos em árgon seco ou azoto gasoso e em todos os passos para minimizar a exposição ao ar.
- Se necessário, suspender os lipídios em clorofórmio ou ciclo-hexano em mg / ml 1-10, nota que as concentrações indicadas pelo fabricante são tipicamente nominal só CUIDADO: Use luvas apropriadas e outros equipamentos de proteção individual, quando a utilização de s....
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Resultados
Nos nossos exemplos, podemos preparar lipossomas a partir de uma mistura de cerca de 55 mol% de POPC (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-fosfocolina), 15% molar POPS (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-fosfo , 30 mol% de colesterol e 0,1% molar de Texas Red-rotulado 1,2-dipalmitoil-sn-fosfoetanolamina (TxR-DPPE). Esta composição foi escolhida como representante de aproximadamente lípidos do gânglio da raiz dorsal 18. Notamos que 15% em mol carregada lípido (aqui POP) está perto do limite .......
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Discussão
Eletropolimerização de lipossomas gigantes tornou-se uma técnica flexível compatível com diversos lipídios, preparações, e tampões. O controle cuidadoso do processo de deposição de lipídios é o mais crítico para o sucesso. Nós apresentamos ferramentas simples para fazer a deposição controlada de lipídios a partir de pequenas preparações de lipossomas um processo simples. A humidade relativa é crítico para o bom desidratação dos lipossomas iniciais, e o valor óptimo variará com a concentração inicial dos solutos na suspe.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Agradecemos Bryan Venema e Eric Martinson para a construção do aparelho eletropolimerização. Este trabalho foi financiado por doações do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde (R01GM100718 para SEG) eo Instituto Nacional de Eye of the National Institutes of Health (R01EY017564 para SEG).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Multímetro digital | Agilent Technologies, www.agilent.com | U1232A ou similar | Qualquer multímetro serve, mas evite ohmímetros analógicos de estilo antigo que aplicam muito mais corrente à resistência em teste. |
| Fluke | 117 ou 177 | Qualquer multímetro serve, mas evite ohmímetros analógicos antigos que aplicam muito mais corrente à resistência em teste. | |
| Gerador de funções | Agilent Technologies, www.agilent.com | 33210A ou similar | A maioria dos geradores de funções funciona para protocolos simples. Este modelo programável é útil para protocolos avançados de eletroformação. Certifique-se de que o gerador pode conduzir 10 V pico a pico em um 50 Ω carregar |
| lâminas de vidro revestidas com ITO | Delta Technologies, Loveland, CO www.delta-technologies.com | CB-90IN-S107 ou similar | Quebre-as ao meio para fazer duas lâminas, 25 mm x 37 mm |
| Controlador de temperatura | Omega Engineering Stamford, CT www.omega.com | CNi3233 ou similar | |
| Higrômetro | Extech, Nashua, NH, www.extech.com | 445815 | |
| Folha de borracha de silicone | McMaster-Carr Elmhurst, IL www.mcmaster.com | 87315K64 | Use silicone USP Grau VI para sua |
| junta EMI | Laird Technologies www.lairdtech.com | 4202-PA-51H-01800 ou similar | Distribuído pela Mouser www.mouser.com |
| TxR-DHPE | Life Technologies, Carlsbad, CA www.lifetechnologies.comT1395MP | Outros lipídios marcados com fluorescência estão disponíveis, mas o TxR-DHPE é um dos mais brilhantes e fotoestáveis. | |
| POPC | Avanti Lipídios Polares, Alabastro, AL www.avantilipids.com | 850457P ou 850457C | Os lipídios podem ser encomendados como pós (P) ou em clorofórmio (C) |
| POPS | Avanti Polar Lipids | 840034P/C | |
| Colesterol | Sigma-Aldrich | C8667 |
Referências
- Dimova, R., Aranda, S., Bezlyepkina, N., Nikolov, V., Riske, K. A., Lipowsky, R. A practical guide to giant vesicles. Probing the membrane nanoregime via optical microscopy. Journal of Physics-Condensed Matter. 18 (28), S1151-S1176 (2006).
- Giant Vesicles. Luisi, P. L., Walde, P. , John Wiley & Sons Ltd. (2000....
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Reimpressões e permissões
