Um modelo de implante de stent na artéria carótida do rato é descrito. Comparado com outros métodos similares, este procedimento é muito rápido, simples e acessível, oferecendo a possibilidade de estudar em uma forma conveniente a reação da parede vascular para diferentes stents farmacológicos e os mecanismos moleculares de reestenose.
Artigo de método
Um modelo murino de implante de stent na artéria carótida para o Estudo da reestenose
Neste artigo
Resumo
Resumo
Apesar dos progressos consideráveis realizados no desenvolvimento de stents nas últimas décadas, as doenças cardiovasculares permanecem a principal causa de morte nos países ocidentais. Além dos benefícios oferecidos pelo desenvolvimento de diferentes stents farmacológicos, a revascularização coronária tem também os riscos que ameaçam a vida de trombose intra-stent e reestenose. A pesquisa sobre novas estratégias terapêuticas é prejudicada pela falta de métodos apropriados para estudar o implante do stent e os processos de reestenose. Aqui, descrevemos um procedimento rápido e acessível de implante de stent na artéria carótida do rato, que oferece a possibilidade de estudar em uma forma conveniente os mecanismos moleculares da remodelação da embarcação e os efeitos de diferentes revestimentos de drogas.
Introdução
As doenças cardiovasculares causados pela progressão da aterosclerose é a principal causa de morte nos países industrializados. A aterosclerose é uma resposta focal, inflamatória fibro-proliferativa da parede vascular à lesão endotelial 1, resultando na formação de uma placa alargada para dentro do lúmen do vaso, que afectam o fluxo sanguíneo através das artérias coronárias. Mais de 75% dos enfartes do miocárdio resultado da ruptura da capa fibrosa fina da placa inflamada 2. Uma vez que esta complicação pode ser fatal, uma transluminal percutânea (coronária) angioplastia (PTCA) com implante de stent tornou-se a terapia de primeira escolha na prática médica atual. O método permite a dilatação da artéria coronária estreitada e, assim, o restabelecimento do fluxo sanguíneo. Ao mesmo tempo, provoca um grau de lesão no endotélio e parede do vaso 3. No entanto, o efeito a longo prazo desta terapia é limitado por um remodelamento arterial excessivaling e reestenose 4.
Por emprego de stents, a ACPT tornou-se mais eficaz no tratamento de lesões complexas, permitindo revascularização após um navio encerramento aguda 5. Este método diminui a incidência de restenose intra-stent, para menos de 10% 6. Além destes benefícios, a terapia de primeira escolha para a revascularização coronária tem também os riscos que ameaçam a vida de trombose intra-stent e reestenose.
Trombose intra-stent é causada por um de-endotelialização do vaso, seguido por uma adesão maciça de plaquetas e fibrina ao local lesionado. 26% dos pacientes sofrem de trombose intra-stent e 63% morrem de infarto do miocárdio 7. A restenose refere-se ao processo de cicatrização de feridas após trauma mecânico à parede do vaso, envolvendo hiperplasia neointimal (migração e proliferação de células do músculo liso vascular (VSMC), a deposição de matriz extracelular (ECM), e remodelaçãodo navio. Muitas vezes, um procedimento invasivo re-intervenção torna-se necessário dilatate vasos ateroscleróticos severamente estreitadas devido à trombose no stent e reestenose.
Para prevenir a trombose intra-stent, é necessário um tratamento a longo prazo com medicamentos anti-trombóticos 8. Para evitar a reestenose, nova geração de stents farmacológicos eluir agentes anti-proliferativa, como imunossupressores (por exemplo, sirolimus, everolimus, zotarolimus) e drogas anti-câncer (por exemplo, paclitaxel) de um revestimento de polímero por vários meses 9,10. Embora estas drogas diminuir a formação da neointima e reestenose, mantêm um elevado risco de trombose intra-stent através da inibição da re-endotelização.
Após a lesão arterial, a manutenção do compartimento endotelial é essencial para a prevenção de complicações trombóticas. Sob condições fisiológicas, o endotélio humano apresenta uma taxa de volume 11. Sob pathological condições, contudo, a integridade do endotélio é prejudicada, de modo que uma rápida recuperação envolve as células endoteliais maduras e as células progenitoras endoteliais (CPE) em circulação é necessária 12,13.
O estudo destes mecanismos moleculares complexas em animais maiores 14-16 ou na artéria aorta do rato é um processo muito difícil, oferecendo dados limitados 17-19. Para testar a eficácia de novos revestimentos de stents para reduzir a trombose intra-stent e os novos modelos são restenose imperativo.
Nitinol representa a plataforma ideal para stents por causa de sua "alta elasticidade, o efeito memória de forma e boa tolerância nos pacientes, sendo utilizado com sucesso como stents bare-metal em uso clínico. Esta liga tornou possível criar um stent miniaturizado com um diâmetro externo de 500 mm, que podem ser revestidos 20 e implantado na artéria carótida de ratos. O desenvolvimento de uma miniatura nitinol stent para rato carotid artéria, permite o estudo dos mecanismos moleculares precisos induzida por colocação de stent e oferece a possibilidade de testar rapidamente e eficientemente os efeitos de diferentes revestimentos de drogas para prevenir a restenose. Além disso, a existência de diferentes cepas de camundongos knock-out representa uma enorme vantagem para esclarecer o papel dos diferentes moléculas envolvidas no crescimento do neo-íntima e trombose intra-stent.
Protocolo
1. Preparando Stent e Implantação
- O stent-struts (Fort Wayne Metals, Castlebar, Irlanda) foram trançado e depois cortar para o tamanho desejado no Instituto de Tecnologia Têxtil e Engenharia Mecânica, RWTH Aachen University, na Alemanha (Figura 1A).
- Antes da implantação, os stents devem ser transferidos para um tubo de silicone 2 cm, usando uma pinça, e colocada de 2mm a uma extremidade terminal, referida extremidade frontal (Figura 1A).
- A extremidade dianteira deve ser cortado obliquamente, para garantir uma ponta afiada, para implantação.
- Antes da implantação, o stent devem ser abundantemente regado, para assegurar o deslizamento.
2. Implante de stent
- 10-12 semanas de idade C57BL / 6 de tipo selvagem ratos machos, 25-27 g são anestesiados com injecção intraperitoneal de 100 mg / kg de cetamina e 10 mg / kg de xilazina. Anestesia adequada é confirmada antes de cirurgia pela falta de reflexos emovimento barba. Para prevenir o ressecamento, enquanto sob anestesia, os olhos do rato são cobertos por uma película de bepanthene creme.
- Após a depilação e adequada desinfecção da área do pescoço ventral, uma pequena incisão mediana de 1 cm é realizada sob um microscópio estereoscópico, utilizando uma tesoura. Depois de separar os dois corpos gordos com pinças curvas estéreis, a artéria carótida comum esquerda, pode ser visto cíclico juntamente com a traqueia.
- 1 cm da artéria carótida comum esquerda ea bifurcação deve ser livre preparado. Um nó com um fio de 5/0 de seda irá ser ligado em torno da artéria carótida comum esquerda, 2 nós, utilizando 7/0 fio de seda vai ser ligado em torno da artéria carótida externa esquerda, e um nó com um fio de 7/0 seda será ligado em torno da artéria carótida interna (figura 1B).
- O fluxo de sangue é, então, interrompida através da ligação dos nós na artéria carótida interna e da artéria carótida externa firmemente proximal, bem como, puxando o nó de surroundção da artéria carótida comum. O recipiente deve ser fixado de uma maneira que a artéria carótida comum e externa são em linha recta.
- Uma pequena incisão na artéria carótida externa é realizado, próximo do nó proximal, utilizando uma tesoura Vannas. O tubo de silicone contendo o stent é introduzido na artéria carótida externa, com a ponta à frente, utilizando um fio-guia. Após o stent atinge a posição desejada, o tubo de silicone é puxado para trás por cima do arame de guia e permite a expansão com memória de forma do stent (Figura 1B).
- O nó distai na artéria carótida externa é ligar firmemente para fechar o local da incisão e os nós na artéria carótida comum e interna são removidos, restaurando assim o fluxo sanguíneo.
- A incisão na pele é fechada com grampos de sutura 3-4 Michel e um Michel fórceps. O mouse é colocado sob a luz vermelha até a recuperação completa. Um tratamento analgésico não é necessário.
- Oplaca pode ser analisada após 1-3 semanas. Para estudar a re-Endotelização, um ponto do tempo do fim mais cedo é necessário (3-4 dias). Observou-se no nosso modelo de implante de stent que 4 semanas após a intervenção cirúrgica, em particular através da utilização de revestimentos específicos para os stents biofunctionalize miniaturizados, neoangiogénese ocorre em aproximadamente 30% da amostra. Este é um processo posterior para a remodelação e regeneração, com diferentes mecanismos e que representam um outro problema patológico. Para concentrar a formação da neointima, estenose in-stent e / ou análise dos mecanismos subjacentes a esses efeitos secundários após o implante de um ponto de três semanas de tempo de fim seria benéfico para não misturar-se com os efeitos regenerativos induzidas pelo aparecimento da neoangiogénese.
3. Análise da formação de placas
- No ponto de tempo final, os animais são anestesiados com injecção intraperitoneal de 100 mg / kg de cetamina e 10 mg / kg de xilazina.Anestesia adequada é confirmada antes de cirurgia pela falta de reflexos e movimento barba.
- Os animais são mortos por sangria intracardíaca. O soro de sangue é recolhido para análise posterior.
- Depois de abrir a cavidade torácica e PBS de lavagem através de punção intracardíaca, um organismo de perfusão com uma solução de paraformaldeído a 4% (PFA) é realizada durante 5 min. A artéria carótida esquerda contendo o stent é dissecado, directamente colocadas numa solução de 4% de PFA e, pelo menos, 16 horas mais tarde embbeded em plástico.
- 50 seções espessas mM são realizados a partir de amostras de plástico embutido usando uma banda serra de diamante.
- Para medir o tamanho da placa, é realizada coloração de Giemsa.
- Para analisar a taxa de re-endotelização stent dentro da área do vaso, a imunohistoquímica para factor de von Willebrand (vWF) é executada.
Resultados
- A implantação de uma miniatura nitinol stent na artéria carótida esquerda de ratos leva 25-30 min e mostra uma taxa de mortalidade de 10%, principalmente devido ao dano do navio durante a intervenção. Uma melhor taxa de sobrevivência é observada em ratinhos com um peso superior a 25 g, no tempo da implantação do stent (taxa de mortalidade de 5%). Portanto, nós escolhemos para os ratos de implantação, com um peso entre 25-27 g. Após a cirurgia, os ratos recuperar da anestesia dentro de 2-5 min e sem deficiências físicas, como por exemplo, paralisia, são observados. Micro-Tomografia Computadorizada (Micro-CT) realizada uma semana após a implantação do stent mostraram que os stents não são deslocadas pelo fluxo de sangue (Figura 1C). Infelizmente, a análise de formação de neoíntima na estas imagens não é possível, devido aos artefactos de metal derivados (Figura 1D, 1E).
- Nós não observamos qualquer navio ou danos endoteliais da área unstented da embarcação, imediatamente abaixo do stent, Detectada pela histológico (Figura 2A) e por coloração específica para endotélio (Figura 2B, anti-ratinho CD31 anticorpo). Para uma melhor visão, a seção foi escaneado usando um microscópio de varredura a laser de dois fótons (Figura 2B, 2C).
- No vaso com stent, uma dilatação permanente de 15% é detectada (razão de stent: artéria, 1,15:1) por ratos com um peso entre 25-27 g. A formação da neoíntima e formação de trombos pode ser analisada por colorações histológicas clássicos (por exemplo Hematoxilina-eosina, Giemsa, Movat, Azul de Toluidina, Masson Trichrom-Goldner, a Figura 3A, 3B). Uma vez que a lâmina externa e interna não são visíveis mais, tamanho da placa foi calculado como a diferença entre o externo e as áreas luminais (média de área de placa: 234.566 ± 3,315 mM 2, a média de área luminal: 12,036 ± 2,662 mM 2). Circunferência externa também foi medido (média de 1799 ± 14 mm). Para a análise dacomposição celular, as secções precisam ser deplastified e coradas com marcadores específicos. Para a re-endotelização, foi utilizado um anticorpo anti-CD31 conjugado com Cy3 e para a proliferação de células do músculo liso de um anticorpo anti-SMA-FITC conjugado (Figura 3C). Reendotelização foi calculado como percentagem de CD-31 coradas positivamente para a superfície luminal totais (média: 23,07 ± 3,14%), uma semana após a implantação do stent.
É claro que um número ilimitado de coloração específica é possível, dependendo da experiência de cada laboratório. Análise da miosina de cadeia pesada, para uma melhor caracterização das células musculares lisas, mas também a análise de células infiltradas (monócitos, linfócitos), ou colorações para diferentes citoquinas inflamatórias também podem ser realizadas, de acordo com o objectivo do estudo.
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Figura 1. Visão esquemática do procedimento cirúrgico (A). O fluxo de sangue é interrompido, ligando os nós na artéria carótida interna e da artéria carótida externa firmemente proximal, bem como, puxando o nó em torno da artéria carótida comum. O tubo de silicone contendo o stent é introduzido na artéria carótida externa através de uma pequena incisão na artéria carótida externa. Após o stent atinge a posição desejada, o tubo de silicone é puxado para trás por cima do arame de guia e permite a expansão com memória de forma do stent. Micro-CT imagens que mostram a posição do stent, uma semana após a implantação cirúrgica (B). Devido aos artefactos materiais derivados, uma análise do crescimento da neointima não é possível (C, D).
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Figura 2. Unstented área do recipiente não é afectada pelo procedimento cirúrgico, como mostrado por Azul de Toluidina (A) e CD31 coloração específica de endotelial (B, C).
Figura 3. Análise da placa pode ser realizada por colorações histológicas clássicos (por exemplo Masson Trichrom-Goldner) (A). O trombo organizados pode ser detectada por deposição de fibrina cor preta no interior do neo-intima, em alguns casos, uma completa oclusão do vaso é observada (B). Re-Endotelização (Cy3, vermelho) ou a proliferação de células musculares lisas (FITC, verde) foi detectada pela técnica de imunofluorescência dupla, usando marcadores específicos.A contracoloração foi realizada com 4 ',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, azul) (C). Percebemos uma completado reendotelização das hastes do stent (seta para a esquerda, o dobro) em relação a um incompleted luminal reendotelização (direita, seta simples).
Discussão
Para reduzir o risco de trombose intra-stent e restenose e sustentar o desenvolvimento de novos revestimentos para stents farmacológicos, um método fácil, simples e acessível do stent em um modelo animal é necessária. Ratos entregar o sistema ideal para estudar os mecanismos complexos de remodelação arterial após a implantação do stent e a eficiência de tais drogas. Modelos de reestenose intra-stent em rato existentes são difíceis, exigem altas habilidades cirúrgicas e implica elevados riscos de complicações como sangramento ou paralisia 17-19. Por exemplo, no modelo de implante do stent na aorta torácica de um rato dador após balão de dilatação do vaso e, em seguida, o transplante do segmento de stent na artéria carótida de um rato receptor 17, o estudo dos mecanismos de pato-não está influenciado apenas por reacção destinatário material dador, mas também pela enorme prejudicial dos vasa vasorum e adventícia. Implantação de um stee inoxidávell stent directamente na aorta abdominal após a dilatação de balão 19 é seguido por uma elevada taxa de mortalidade (35%) devido à paralisia perna após trombose ou hemorragia da aorta abdominal no local da arteriotomia. Implantação de um em forma de espiral auto-expansível de nitinol-stent em aorta abdominal através da artéria femoral 18 precisa de altas habilidades cirúrgicas, principalmente devido à cegamente dirigir o stent ao longo da ramificação da artéria femoral de aorta para colocar o stent na posição correta. Este procedimento é seguido por um alto risco de danificar o nervo femoral, portanto, paralisia da perna traseira. Comparado com estes procedimentos, o nosso modelo de implante de stent em rato não precisa de altas habilidades cirúrgicas.
Nosso modelo oferece um método simples, fácil e eficiente para analisar os efeitos de diferentes drogas revestimentos no remodelamento arterial, a colocação do stent é feito sob visão, e não há riscos de danificar os nervos ou outras estruturas. O commecanismos moleculares complexas podem ser investigados mais fácil em nosso modelo de rato stent na artéria carótida, não só pela acessibilidade direta do navio, mas também devido à existência de diferentes cepas de camundongos knock-out.
Como uma limitação, comparando com o procedimento clínico, o nosso modelo utiliza camundongos / artérias saudáveis e não realiza implante de stent em placas pré-existentes (não reestenose intra-stent, mas estenose intra-stent). Nós também não executar balão dilatação antes de stent-implantação. No entanto, devido ao grande dano da parede dos vasos em ambos os modelos, os processos são semelhantes reparadoras. Infelizmente, devido aos artefatos de metal derivados, uma monitorização in vivo do crescimento neointimal não é possível por métodos de imagem existentes, como ultra-som ou computador tomografia. Outro fator limitante é a secção fina de stents baseados em metal, o que requer alguma experiência no processamento de metais.
Usando este método, nós éramoscapazes de mostrar que, por neutrófilos, instruindo-biofunctionalized miniaturizado nitinol stents revestidos com o LL-37 reduzem a restenose intra-stent, proporcionando um novo conceito para promover a cura vascular após terapia de intervenção 21.
Apesar destas limitações, este modelo parece ser, até agora, o sistema mais adequado, assim, dinheiro e economia de tempo, para investigar novas drogas revestimentos de stents e seus efeitos sobre os eventos moleculares durante a remodelação arterial. Além disso, este modelo pode ser facilmente adaptado para o hamster, que é mais semelhante à humana, de modo que todas as hipóteses terapêutico pode ser verificada, antes de aplicar a animais maiores ou humanos a fim de evitar os efeitos desagradáveis e inesperadas.
Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Agradecemos a Sra. Angela Freund para a assistência técnica excelente na secção dos stents embutidos plástico. Agradecemos também a Sra. Roya Soltan e Sra. Angela Freund para a ajuda profissional com coloração imuno-histoquímica.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| stents de nitinol (feitos por si mesmos a partir de suportes de nitinol) | Fort Wayne Metals, Castlebar, Irlanda NiTi#1, superelástico, recozido reto, óxido leve, diâmetro 500 μ m | produto feito sob medida | Instituto de Tecnologia Têxtil e Engenharia Mecânica |
| tubo de silício | IFK Isofluor, Alemanha | feito sob medida | diâmetro 500 μ m, espessura da seção 100 μ m, estereomicroscópio de cateter de politetrafluoretileno |
| Olympus | SZ/X9 | ||
| fórceps | FST, Alemanha | 91197-00 | ponta padrão curvada 0,17 mm |
| Cetamina 10% | CEVA, Alemanha | ||
| Xylazine 2% | Medistar, Alemanha | ||
| Bepanthene | Bayer, Alemanha | ||
| Tesoura | FST, Alemanha | 91460-11 | Tesoura |
| reta Vannas | Aesculap, Alemanha | OC 498 R | |
| 5/0 Silk | Seraflex | IC 108000 | |
| 7/0 Silk | Seraflex | IC 1005171Z | |
| fio-guia | Abbott Vascular | 1001782-HC | 0,014 polegadas angioplastia-fio-guia |
| clipes de sutura | Aesculap, Alemanha | BN507R | 7,5 x 1,75 milímetros |
| Michel Forcep | Aesculap, Alemanha | BN730R |
Referências
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Reimpressões e permissões
