Geração de Alinhados tecido funcional do miocárdio através de impressão microcontact

Apesar dos recentes avanços na terapia médica, insuficiência cardíaca avançada é a principal causa de mortalidade e morbidade no mundo desenvolvido. A síndrome clínica surge de uma perda de tecido funcional do miocárdio e, posteriormente, uma incapacidade do coração insuficiente para atender as demandas metabólicas de indivíduos afetados. Como o coração tem uma capacidade limitada de regeneração, o transplante autólogo de coração é a única terapia atual clinicamente aceito diretamente destinado a reabastecer o tecido do coração perdido funcional. Desvantagens significativas do transplante cardíaco, incluindo um número limitado de corações de dadores e a necessidade de uma terapia de longo prazo imunossupressora, impede a utilização ampla desta terapia. Como resultado, a terapia médica tem sido a base do tratamento para os pacientes com doença de coração. Um dos principais desafios no desenvolvimento de drogas é a identificação de ensaios celulares com precisão que recapitulam normal e doente fisiologia do miocárdio in vitro.

A recente convergência da biologia de células-tronco e tecnologia de engenharia de tecidos levanta novos caminhos promissores para a regeneração cardíaca. Gerando tecido miocárdico funcional a partir de uma fonte renovável paciente específico seria um grande avanço no campo. Isto permitirá o desenvolvimento de doenças específicas ensaios celulares para desenvolvimento de drogas e de descoberta e iria lançar as bases para a medicina regenerativa cardíaca. Homem-tronco embrionárias (ES) células e, mais significativamente, humanos-tronco pluripotentes induzidas (iPS) células representam uma potencial fonte renovável paciente específico de células progenitoras ventriculares e miócitos ventriculares maduros. A combinação da biologia de células-tronco e as estratégias de engenharia de tecidos resolve este problema através da geração de tecido do coração funcional in vitro que pode ser utilizado no desenvolvimento de ensaios celulares para a descoberta de drogas ou em abordagens cardíacas regenerativos para o tratamento da insuficiência cardíaca avançada.

_content "> Um desafio central na regeneração cardíaca tem sido a identificação de um tipo de célula ideal. Uma vasta gama de células têm sido estudados ^1, no entanto até à data, embora diferentes precursores cardiogênicos multipotentes a partir de várias fontes, foram descobertas, a identificação de uma célula fonte que atenda aos requisitos críticos, tais como comprometimento com o destino das células miogênicas, a manutenção da capacidade de expandir-se in vivo ou in vitro e da composição a um tecido funcional do miocárdio provou ser um problema central ^2. Temos anteriormente descrito um sistema transgénico duplo murino que permite o isolamento de populações altamente purificadas de células progenitoras comprometidas ventricular (PVC) de células ES de diferenciação in vitro. Geramos um ratinho transgénico duplo novela que expressa a proteína fluorescente vermelha DsRed sob o controlo de um intensificador ISL1-dependente do gene e MEF2C a proteína verde fluorescente melhorada sob o controlo deo cardíacas específicas Nkx2.5 potenciador. Com base neste sistema repórter de duas cores fluorescentes, células progenitoras cardíacas primeiro e segundo campo de células ES de desenvolvimento podem ser isolados por meio de separação de células activadas por fluorescência (FACS) de acordo com a expressão de genes MEF2C e Nkx2.5. CVP assemelham miócitos cardíacos com base nos padrões de expressão de marcadores do miocárdio e qualidades estruturais e funcionais ^3, que oferece uma grande promessa para fins regenerativos tecido cardíaco.

Embora tenha havido muitos avanços no campo da engenharia de tecidos, imitando arquitetura celular nativa continua a ser um desafio fundamental. Os métodos convencionais para enfrentar este desafio são semeadura andaimes biológicos ou sintéticos com células in vitro. Devido a uma série de desvantagens dos andaimes, incluindo a degradação rápida, a estabilidade física e mecânica limitada e baixa densidade celular ^1,4,5, procurou-se a engenharia de andaime, menos tecido. Altcélulas Hough cardíacos podem modificar seu microambiente local através da secreção de proteínas da matriz extracelular, eles têm uma capacidade mais limitada de se organizar para haste em forma de miócitos cardíacos, na ausência de sinais extracelulares. Assim, um modelo que fornece as células apropriadas pistas espaciais e biológicas para compor tecido miocárdico funcional é requerida. Impressão microcontact aborda este desafio, fornecendo uma técnica simples e de baixo custo para controlar com precisão a forma da célula, a organização e função ^6-8, todos os quais são cruciais para a geração de tecido alinhado funcional do miocárdio. Ela inclui a utilização de microtextured polidimethilsiloxano (PDMS) selos com tamanhos característicos que vão até 2 m ⁹ que permitem a deposição de proteínas da matriz extracelular em substratos de PDMS em padrões precisos e, por conseguinte, afectar a adesão celular espacialmente.

Aqui, propomos combinar tecnologia de bioengenharia de tecidos com haste cell biologia para gerar tecido funcional anisotrópica do miocárdio. Por conseguinte, temos aqui demonstram a nossa abordagem recentemente publicado para o seguinte: (1) a geração de superfícies de proteína micropatterned em PDMS substratos por impressão microcontact para a geração de um modelo para o tecido do miocárdio alinhados, (2) o isolamento de células progenitoras cardíacas altamente purificada a partir de As células ES de diferenciação in vitro, e (3) a combinação de ambas as técnicas para gerar alinhado tecido funcional do miocárdio.

O protocolo para gerar alinhado tecido funcional do miocárdio pode ser dividida em três partes principais. A fabricação do mestre micropatterned usando técnicas de litografia suave não é considerado parte do protocolo a seguir, mas pode ser feita com base no método estabelecido ^6.

1. Printing microcontact de fibronectina em PDMS Substrates

1. Misture Sylgard 184 (Dow Corning) em elastómero PDMS uma base de 10:1 a cura proporção do agente e desgaseificar o conjunto usando um dessecador para eliminar quaisquer bolhas de ar.
2. Curar PDMS contra um mestre previamente fabricada com 20 um de largura e 2 m de altura cristas, separados por espaçamento de 20 uM para qualquer um 2 dias à temperatura ambiente ou a 4 horas a 65 ° C para se obter selos microtextured PDMS.

* A cura num exsicador é altamente recomendável para eliminar quaisquer bolhas de ar.

3. Spin-coat PDMS em lamelas de vidro (por exemplo,22x22 mm) a 5000 rpm durante 2 min utilizando um revestidor de rotação Headway para produzir finos e ainda PDMS substratos, de 15 um de espessura.
4. Limpar selos com etanol 70% para remover poeira e partículas de sujeira. Deixe-os secar ao ar.

Selos * pode ser usado várias vezes, no entanto, renovando selos PDMS em uma base regular é recomendado devido a uma abrasão da superfície ao longo do tempo.

5. Selos colocar num Plasma-Prep II SPI Cleaner Plasma e processo para 1 min a 275 mTorr para tornar as superfícies de PDMS hidrofílico.

* Tratamento de plasma de oxigênio devem ser observados. Tempos mais longos de tratamento pode resultar em fractura do elastómero.

6. Esterilizar selos com etanol a 70% durante 1 min. Secar rapidamente com ar comprimido.

* Novos passos devem ser realizados numa câmara de segurança biológica para manter a esterilidade.

7. Cubra carimbar superfícies com Fibronectin solução (50 ug / ml em DDH ₂ O). Deixe-a adsorver, pelo menos, 10 min.
8. Sacudir solução fibronectina de selos e secar rapidamente com ar comprimido.
9. Estabelecer contato conformado entre selos e substratos PDMS para 2 minutos e pressione com firmeza.
10. Enxágüe com substratos micropatterned DDH ₂ O. Armazená-los em DDH ₂ O para um máximo de 2 semanas a 4 ° C a menos que inicialmente utilizada. Loja PDMS selos em DDH ₂ O.

2. Manutenção de Double linhagens de células estaminais embrionárias

Primeiro, prepare os seguintes meios para a cultura de células embrionárias de rato:

Rato embrionário fibroblasto (MEF)-Meio: Dulbecco modificado por Eagle (DMEM), 10% de soro fetal bovino (FBS) de células ES ou Differentiation-grade, 1% de Penicilina-Estreptomicina (P / S)

Células-tronco embrionárias (ESC)-Médio: DMEM, 15% FBS ES célula-grade,1% não-aminoácidos essenciais (NEAA), 0,5% P / S, o Factor Inibitório de 0,2% da leucemia (LIF), 0,0007% 2-mercaptoetanol (2-ME)

1. Revestimento de placas de 6 poços com 0,1% de gelatina estéril em DDH ₂ O e deixá-la adsorver 15 min a 37 ° C.
2. Adicionar MEFs partir de uma alíquota descongelada a 50 ml de PBS, num tubo cónico e centrifugar para a 1000 rpm durante 5 min. Ressuspender MEFs no MEF-médio.
3. Após a adsorção, aspirado de gelatina em excesso e MEFs suplemento para os poços. Permitir MEFs dia 1 anexar.

* Uma alíquota de 10 milhões de MEFs suficiente para 3 placas de 6 poços.

4. Quando MEFs ter anexado, adicionar células ES a partir de uma alíquota descongelada a 50 ml de PBS, num tubo cónico e centrifugar para a 1000 rpm durante 5 min. Ressuspender as células ES em ESC médio e adicione-os aos poços contendo MEFs. Cultura de células ES em ESC médio até confluência é atingido.

* Uma vez que as células ES atingiram confluência, passaging é requa fim de evitar o crescimento excessivo IRED e para manter as colónias de células ES.

5. Prepare células-tronco embrionárias para passaging. Aspirado ESC-médio e lave uma vez com PBS estéril.
6. Aspirar PBS e adicionar 500 ul de tripsina. 3.5 Processo min a 37 ° C.
7. Pipetar a solução de tripsina cima e para baixo várias vezes para quebrar as colónias de células ES e neutralizá-la com 500 ul de meio de ESC.
8. As células ES de passagem de acordo com a sua relação desejada, por exemplo, a transferência de 33 uL para o outro bem com previamente preparada MEFs a passagem 1/30. Manter as células ES em ESC-Médio.

* A relação de passagem de 1/30 permite que as células ES para atingir confluência em 3 dias. Células ES de passagem de acordo com a sua programação na diferenciação in vitro.

3. Diferenciação in vitro de Double linhagens de células estaminais embrionárias e isolamento e propagação de células progenitoras cardíacas

Primeiro, prepare o followimedia ng necessário para a diferenciação in vitro de células ES:

Adaptação médio: Média Modificado Iscove da Dulbecco (IMDM), 15% FBS célula ES-grade, 1% de NEAA, 0,5% P / S, 0,2% de LIF, 0,0007% de 2-ME

Diferenciação de Médio: IMDM, 15% FBS Diferenciação grau. NEAA 1%, 0,5%, P / S, 0,35% de ácido ascórbico a 0,1 M, 0,0007% de 2-ME

1. Iniciar diferenciação in vitro quando as células atingiram a confluência ES. Revestimento de placas de cultura de 10 centímetros, com 0,1% de gelatina estéril em DDH ₂ O e deixá-la adsorver 15 min a 37 ° C.

* Ser consciente da duração do processo de diferenciação in vitro. Leva 8 dias até progenitoras cardíacas podem ser isolados. Planeje suas experiências nesse sentido.

2. Colheita células-tronco embrionárias como antes. Após a adsorção, aspirado de gelatina em excesso e adicionar cerca de 1/3-1/2 da suspensão de células ES de cultura preparadopratos contendo Adaptação médio. Células de cultura durante 2 dias.

* Escolha a quantidade de células-tronco embrionárias para a adaptação de acordo com suas experiências.

3. Colheita adaptado células ES para um tubo cónico de 50 ml contendo PBS com 1. 5 ml de tripsina. Centrifugar as células ES dissociadas a 1000 rpm durante 5 min e ressuspender-los em Diferenciação médio.
4. Fazer corpos embrióides (EB) de cerca de 1.000 células por 10 ul gota em 15 placas de cultura de centímetros utilizando uma pipeta multi-canal. Inverter as placas de cultura e EBS como suspensão de gotículas durante 2,5 dias a 37 ° C.
5. Após 2,5 dias, a piscina EBs de 6-8 pratos de cultura de 15 centímetros em um usando Diferenciação médio e cultura para lhes mais 3,5 dias a 37 ° C.
6. Depois de 3,5 dias, recolher EBS em um tubo cônico 50 ml e deixá-los afundar até o fundo por cerca de 5 min. Sugar o sobrenadante e lavar EBS com PBS estéril. Deixe EBs afundar novamente para o fundo para approximately 5 min.
7. Dissociar EBs, processando-os com 2. 5 ml de tripsina, durante 2 minutos num banho de água a 37 ° C agitando suavemente o tubo. Em seguida, adicione 2. 5 ml de PBS estéril com a solução de tripsina e pipetar para cima e para baixo com uma pipeta de 10 ml aproximadamente 8-10 vezes serológico para quebrar aglomerados de células. Neutralizar a tripsina com 10 ml de tampão FACS contendo 7,5% de FBS células ES ou diferenciação de grau e de 0,01% em PBS DAPI.
8. Centrifugar EBs dissociado a 1000 rpm durante 5 min e ressuspender deles em cerca de 1 ml de tampão de FACS. Pipetar cima e para baixo com uma pipeta de 1 ml, aproximadamente 8-10 vezes para quebrar aglomerados de células.

* Adicione tampão FACS de acordo com a quantidade estimada de EBs dissociados. As células também altamente concentrados podem entupir durante FACS e muito baixo de células concentradas podem prolongar o tempo de FACS desnecessariamente.

9. Transferir as células para um tubo de fundo redondo de um filtro estéril com célula de 35 um até se obteruma suspensão de célula única.
10. Células diferenciadas Ordenar ES utilizando um citómetro de fluxo e FACSAria obter purificado populações de PVC.

* Foi desenvolvida uma estratégia modular multi-passo para isolar células altamente purificadas coloridas. Em suma, primeiro portão em Amplitude Forward Scatter (FSC-A) e Amplitude Side Scatter (SSC-A) (Figura 1A). Isto permite-nos separar células inteiras a partir de detritos celulares. Em seguida, portão FSC-A e Forward Scatter Largura (FSC-W) (Figura 1B). Isto permite isolar singlets celulares de dupletos e outros agregados celulares. Em seguida, portão SSC-A e Lado Scatter Largura (SSC-W) (Figura 1C). Isto aumenta a pureza de singletos celulares. Em seguida, no portão coloração DAPI para isolar as células viáveis ​​(DAPI-negativa) a partir de células não viáveis ​​(Figura 1D). Em seguida, no portão Phycoeryhthrin Amplitude (PE-A) e PE-cianina 7 corante Amplitude (PE-Cy7-A) para obter verdadeiro-positivo vermelho (R ⁺ - células) e para excluir autofluorescente vermelho-negativas células (Figura 1E). R ⁺ e R ^- são, em seguida, as células gated em separado em fluoresceína Amplitude isotiocianato (FITC-A) e PE-A para ordenar verdadeiros-positivos verde (G ⁺⁾ e verdadeiros negativos verde (G ^-) células dentro dessas populações (Figura 1F + 1G). Isto resulta em quatro populações de células como se segue: R ⁺ G ^+, R ⁺ G ^-, R ^- G ⁺ e R ^- G ^- (Figura 1H).

11. Passivar micropatterned substratos com 1% de Pluronic F-127 em DDH ₂ O durante 10 min. Em seguida, lave-3x com PBS estéril.

* Pluronic F-127 é um surfactante que bloqueia a adesão de células. Ela suporta o confinamento de adesão celular a área micropadronadas.

12. Anexar juntas PDMS em torno da região modeladae pressione com firmeza. Então CVP semente, sobre substratos fibronectina micropatterned.

FACS-purificação de células in vitro diferenciadas ES revelou quatro populações distintas de células progenitoras (figura 1). A presença de fibronectina micropatterned foi confirmada por microscopia de imunofluorescência, que exibia uma transferência completa de fibronectina linhas contínuas (Figura 2). Chapeamento de FACS-isoladas células progenitoras para micropadrões fibronectina resultou em alinhamento do G + R + e parte do R - G + populações. Embora Pluronic F-127 como um bloqueador de suporte de adesão celular foi usado, o R + G - e R - G - populações não respeitou a arquitectura anisotrópica de fibronectina e cresceu para dentro do espaço entre linhas adjacentes de proteína (Figura 3).

Figura 1. Represe citometria de fluxo gráfico ntative do dia 6 em células ES in vitro diferenciados. (A) Gating em Amplitude Forward Scatter (FSC-A) e Amplitude Side Scatter (SSC-A). (B) Gating em FSC-A e Forward Scatter Largura ( FSC-W). (C) Gating no SSC-A e Lado Scatter Largura (SSC-W). Gating (D) na coloração DAPI. (E) Gating para Phycoeryhthrin (PE) e PE-cianina corante 7 (PE- Cy7) (F e G) para Gating Fluoresceína Amplitude isotiocianato (FITC-A) e PE-A (H) Citometria de fluxo trama revelando quatro populações distintas de células progenitoras:.. I + G +, R + G -, R - G + e R - G -. Clique aqui para ver maior figura .

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Figura 2. Imunofluorescência representante de substratos micropatterned fibronectina. Barra Escala, 80 m.

Figura 3. A microscopia de imunofluorescência representante de embrião (A) e de células ES derivadas (B) FACS-isoladas células progenitoras após um período adicional de 5 dias de cultura na micropadrões fibronectina Núcleos, azul,. SmMHC, vermelho; sarcomérica α-actinina, verde. Barra de escala, 40 m. Reproduzido de Domian et al. (2009).

Os autores declaram que não têm interesses conflitantes financeiros.