Aqui descrevemos uma técnica de microdissecção seguido de injeção de corante fluorescente no gânglio acústico de embriões de galinha cedo para rastreamento seletivo das fibras auditivas axônios no nervo e rombencéfalo.
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Artigo de método
Rastreamento seletiva de fibras no nervo auditivo embrionário aviária Vestibulococlear
Neste artigo
Resumo
Resumo
O pintainho embrionário é um modelo largamente utilizado para o estudo das projecções periféricas e centrais de células ganglionares. No sistema auditivo, rotulagem seletiva de axônios auditivos dentro do nervo craniano VIII aumentaria o estudo do centro de desenvolvimento circuito auditivo. Esta abordagem é difícil porque múltiplos órgãos sensoriais do ouvido interno, contribuir para o nervo VIII 1. Além disso, os marcadores que distinguem de forma confiável auditivo versus grupos vestibulares de axónios no interior do nervo VIIIth aviária ainda têm de ser identificados. Vias auditivas e vestibulares não podem ser distinguidas funcionalmente em embriões precoces, como sensoriais evocadas respostas não estão presentes antes dos circuitos são formados. Centralmente projetando axônios VIII foram traçadas em alguns estudos, mas auditivo rotulagem axônio foi acompanhada de rotulagem de outros componentes do nervo VIII 2,3. Aqui, nós descrevemos um método para o rastreio anterógrada do gânglio acústico para selectivamente labeaxónios auditivas l dentro do nervo VIIIth desenvolvimento. Em primeiro lugar, após o esvaziamento parcial da região cefálica anterior de um embrião de pinto com 8 dias de imersão em fluido cerebrospinal artificial oxigenado, o ducto coclear é identificado por anatómicas. Em seguida, uma micropipeta de vidro fino puxado está posicionado para injectar uma pequena quantidade de rodamina dextran amina na região adesiva e profunda adjacente onde as células ganglionares acústicos estão localizados. Dentro de 30 minutos após a injeção, os axônios auditivas são rastreados centralmente na parte posterior do cérebro e posteriormente pode ser visualizado a seguir à preparação histológica. Este método proporciona uma ferramenta útil para estudos do desenvolvimento da formação periférica de circuito auditivo central.
Protocolo
1. Preparar os instrumentos de dissecação seguinte e Reagentes
- Fluido cerebrospinal artificial (aCSF; 130 mM de NaCl, 3 mM KCl, 1,2 mM de KH 2 PO 4, 20 mM de NaHCO3, 3 mM de HEPES, 10 mM de glicose, 2 mM de CaCl2, 1,3 mM MgSO4) infundida continuamente com 95% de O 2/5% CO 2, à temperatura ambiente. Para a perfusão, encher a 2/3 de 500 ml de boca larga frasco Nalgene com um buraco perfurado na tampa. Tanque vai ser ligado a um tubo de um borbulhador de vidro haste, que penetra o aCSF através do orifício na tampa do frasco. Regule a pressão para se obter um fluxo constante de bolhas....
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Resultados
Os componentes do nervo VIII e a anatomia do nervo em si são complexas e tortuosas (Figuras 1, 3). Seletivamente o rastreio fibras resultantes a partir de células do gânglio acústicos, os segmentos do nervo VIII, bem como aferentes auditivos primários dentro do tronco cerebral podem ser rastreados de forma limpa e distinguidos dos seus homólogos vestibulares (Figuras 2, 3). Do mesmo modo, esta técnica pode ser utilizada para estudar as projecções periféricas das células ganglionares acú.......
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Discussão
Estudos sobre o desenvolvimento precoce do nervo VIII têm sido limitada, em parte, devido à dificuldade em identificar os axônios embrionárias resultantes de gânglios distinto múltipla. Vários estudos exploraram os sinais moleculares orientadores auditivo e vestibular célula sensorial e destinos de células ganglionares durante o desenvolvimento precoce, 5,11,12 mas os processos que regulam a inervação central têm ainda a ser determinado. Relatórios de projeções das células ganglionares acústicas normalmente d.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Candace Hsieh para sugestões e assistência com técnicas de imagem e Doris Dr. Wu para a perícia no pinto anatomia do ouvido interno durante a embriogênese. Este trabalho foi financiado pela NSF IOS-0642346, NIH T32-DC010775, NIH T32-GM008620, NIH R01-DC010796, e GAANN DOE P200A120165.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente / Material | Companhia | Número de catálogo | Comentários |
| Poliestireno Pesar | Fisher Scientific | 02-202-101 | |
| Prato de Petri, 35 X 10 mm | Fisher Scientific | 50820644 | Use para fazer prato dissecção de silicone |
| Sylgard Kit elastômero de silicone | Instrumentos de Precisão mundo | SYLG184 | Brasão Petri para fazer prato dissecção |
| Pinos de dissecação | Vário | Embrião mantém no local durante a dissecção | |
| NaCL | Vário | parte da receita aCSF | |
| KCl | Vário | parte da receita aCSF | |
| KH 2 PO 4 | Vário | parte da receita aCSF | |
| NaHCO3 | Vário | parte da receita aCSF | |
| Glicose | Vário | parte da receita aCSF | |
| CaCl 2 | Vário | parte da receita aCSF | |
| MgSO4 | Vário | parte da receita aCSF | |
| Recipiente para aCSF. Sugerem translúcido boca larga frasco de Nalgene, 500 ml (16 onças) com tampa. | CPLabSafety | QP-PLC-03717 | Abertura do orifício na parte superior da tampa para haste de vidro bubling penetrar líquido |
| Vazio 5 ml frasco de vidro ou frasco transparente e comparável | Farmacêutica americana Partners, Inc | 6332300105 | Utilização durante a incubação aCSF para manter as amostras separadas umas das outras e do fluxo de borbulhamento |
| Tanque de carbogénio (95% O2 / 5% CO 2) ligada a um tubo de borbulhador | Vário | Anexar por tubulação para borbulhador haste de vidro para perfusão aCSF | |
| Vidro tronco borbulhador | Vário | Para infundir carbogênio em aCSF | |
| Curvo-ponta fórceps | Instrumentos de Precisão mundo | 501008 | Para remover a cabeça do embrião do ovo |
| Dois bem-ponta fórceps | Instrumentos de Precisão mundo | 501985 | Para micro-dissecção |
| 50 ml Proveta | vário | ||
| Rodamina Dextran Amine (RDA) | Invitrogen | vário | Fluorescente axônio traçador |
| Triton X-100 | ICN Biomedicals | ||
| Solução salina tamponada com fosfato, (1X PBS) | Vário | Reagente de laboratório padrão | |
| Fina parede capilares de vidro, 1,2 OD, 0,9 ID 4 "(100 mm) de comprimento | Instrumentos de Precisão mundo | TW120F-4 | Carregar com a RDA. Cada capilar faz duas micropipetas de vidro |
| Agulha / Pipetar extrator | David Kopf Instruments | Modelo 720 | Configurações usadas: Calor 16,4, 2,2 Solenóide |
| Picospritzer | Parker Instrumentation | vário | Anexar por tubos de vidro fino para micropipeta |
| Micromanipulador | Narishige | vário | |
| Microscópio de dissecção com fluorescência | Vário | ||
| Paraformaldeído a 4% | Vário | Reagente de laboratório padrão | |
| anticorpo anti-neurofilamento, opcional | Millipore | AB1991 | Siga o protocolo recomendado pelo fabricante histológica |
| Criostato e materiais associados para seccionamento | Leica | vário | |
| Microscópio de epifluorescência para imagiologia | Zeiss, vários |
Referências
- Groves, A. K., Fekete, D. M. Shaping sound in space: the regulation of inner ear patterning. Development. 139, 245-257 (2012).
- Pflieger, J. F., Cabana, T. The vestibular primary afferents and the vestibulospinal pro....
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Reimpressões e permissões
