Criando Gradientes adesivas e solúvel para a migração celular Imaging com Microscopia de Fluorescência

Resumo

Um método para a montagem de gradientes de adesivo e solúvel em uma câmara de microscopia para estudos de migração de células vivas é descrito. O ambiente artificial combina superfícies antivegetativas e faixas adesivas com gradientes de solução e, portanto, permite que se determine a importância relativa das pistas de orientação.

Resumo

As células podem detectar e migram para as concentrações mais elevadas de pistas adesivas, tais como as glicoproteínas da matriz extracelular e as pistas solúveis, tais como factores de crescimento. Aqui, descrevem um método para criar gradientes opostos de pistas adesivas e solúvel em uma câmara de microfluidos, que é compatível com imagens de células vivas. Um copolímero de ácido poli-L-lisina e o polietileno glicol (PEG-PLL) é empregada para passivar lamelas de vidro e prevenir a adsorção não especifica de biomoléculas e células. Microcontact impressão seguinte, ou litografia dip caneta são usados ​​para criar as faixas de estreptavidina nas superfícies passivadas para servir como pontos de fixação para o péptido biotinilado arginina-glicina-ácido aspártico (RGD) como a pista adesiva. Um dispositivo de microfluidos é colocada sobre a superfície modificada e usados ​​para criar o gradiente de pistas adesivas (100% RGD a RGD 0%) nas faixas de estreptavidina. Finalmente, o mesmo dispositivo de microfluidos é usado para criar um gradiente de uma suc chemoattractanth como soro fetal bovino (FBS), como o cue solúvel na direcção oposta do gradiente de pistas adesivas.

Introdução

Migração dirigida de células é uma propriedade fundamental de muitas células e é um aspecto-chave de muitos processos fisiológicos normais, incluindo o desenvolvimento embrionário, a defesa contra a infecção e cicatrização de feridas. Além disso, a migração de células também desempenha um papel importante em várias doenças tais como a doença vascular, metástase de células tumorais e de ^1,2 a inflamação crónica. Embora os estados clássicos da migração das células - polarização, extensão saliência, a formação de aderência, a geração de forças de retracção e de trás - são geralmente aceites ^3,4, a elucidação dos mecanismos de espaço-temporais, que por integração do sinal é coordenado tem sido mais difícil.

A matriz extracelular (ECM), que serve como um substrato para a adesão celular, e através de química inerente ⁵ e ⁶ diversidade física, fornece indicações direccionais para navegação célula ^7,8. Além destas pistas adesivas ^9, factores solúveis ^{10-12 <}/ Sup>, como quimiocinas e fatores de crescimento pode induzir a migração de células por meio de receptores dirigido quimioatratantes e sua sinalização a jusante motogenic. Actualmente, não se sabe se o acoplamento e a sinalização através de receptores de adesão (integrinas, por exemplo) ou de receptores quimiotáticas, tais como receptor da tirosina quinase (RTK), são dominantes. Também não é conhecido se as hierarquias de sistemas receptores são específicos do tipo de célula.

Microscopia de células vivas dá uma riqueza de informações que não é acessível em ensaios a granel e pode ser combinado com dispositivos microfluídicos para gerar gradientes de imobilizados pistas ^13,14 e solúvel ^{15 16.} O método descrito aqui utiliza uma série de passos simples e bem estabelecida para a modificação de superfície em conjunto com uma câmara comercialmente disponível microfluídico para criar uma imagem de ensaio para a migração de células que podem ser facilmente implementados em um laboratório de biologia das células (Figura 1). O montadodispositivo micro tem qualidades ópticas que são comparáveis ​​aos do vidro ¹⁷ e os gradientes de moléculas difusíveis são estáveis ​​durante pelo menos 16 horas. O sistema pode ser usado para as técnicas de microscopia de epifluorescência e avançado. Ao contrário de outras configurações de quimiotaxia ^18, este sistema é adequado para a gravação lentamente migram, as células aderentes. É importante notar que o sistema é modular e facilmente permite a introdução de adesivo alternativa ou pistas de migração solúveis e análise de vários tipos de células.

Protocolo

1. Passivação de lamínulas com PLL-PEG-biotina

Este passo é projetado para passivar a superfície para que as células aderem e migram para regiões específicas na lamela de vidro que são criados com a impressão microcontract (Passo 2-3a) ou mergulho litografia caneta (Passo 3b). Para a passivação, um co-polímero de poli-L-lisina (PLL) e polietileno glicol (PEG) é usado em que 20% das moléculas de PEG são enxertados com biotina (PLL-PEG-biotina).

1. Para limpar lamelas de vidro (18 mm x 18 mm), submergindo-os em uma cremalheira em etanol a 100% e colocar o suporte de um banho de sonicação durante 30 min. Secam-se as lamelas de vidro em ar ou sob uma corrente de azoto.
2. Em seguida, sonicar as lamelas de vidro durante 30 min em 1 M NaOH. Depois enxaguar as superfícies de vidro por imersão cuidadosamente o suporte em um recipiente cheio com 1,5 L Milli-Q H ₂ O. Repetir o processo de lavagem três vezes com água Milli-Q fresco H ₂ O a cada vez. Secam-se as lamelas de vidro emnum forno a 60 ° C.
3. Coloque metade o vidro limpo Lamelas individualmente numa câmara húmida, a qual é feita de uma placa de 24 cavidades parcialmente cheio com H ₂ O. Gota 15 ul de PEG-PLL-biotina (1 mg / ml) em PBS em cada lamela de vidro. Levar a outra metade dos restantes lamelas de vidro limpo e cuidadosamente sanduíche a solução PEG. Deixar as lamelas durante 1 hora na câmara húmida. Deslize suavemente as lamelas ensanduichada longe um do outro sem raspar a superfície de PEG-revestido e lavá-los com água Milli-Q H ₂ O. A água deve deslizar facilmente sobre o lado PEG-tratada. Se necessário, o ar de secagem as lamelas de vidro sobre uma toalha de papel com a superfície tratada para cima. Armazenar as lamelas de vidro num exsicador de vácuo até à sua utilização.

2. Fabricação de carimbos para impressão microcontact

Descrevemos dois processos para faixas estreptavidina padrão para as lamínulas passivadas. O primeiro, microcontact impressão, tipicamente requer a fabricação de um mestre de silício a partir do qual um carimbo de PDMS é moldado. No nosso caso, o padrão sobre o selo PDMS são 100 mm de largura, as linhas que estão espaçados 290 uM de centro-a-centro, com uma altura característica de 25 um. Abaixo, descrevemos resumidamente como fabricar um mestre silício adequado (Passo 2,1-2,3) e PDMS selo (Passo 2.4). No entanto, existem vários protocolos para a impressão microcontact descritos na literatura ^19-23, que são adequados para a impressão de padrões de proteínas sobre lamelas de vidro. Mestres também podem ser feitas sob encomenda e adquirido a partir de fontes comerciais.

1. Em primeiro lugar, limpar a bolacha de silício (4 "de diâmetro) através da incubação em solução piranha (3:1 v: v de ácido sulfúrico e peróxido de hidrogénio a 30%). Durante 20 minutos Lavar cuidadosamente a bolacha 10 vezes com H ₂ O. MilliQ Seca-se a bolacha em um forno a 150 ° CO / N.
2. Enxaguar a bolacha de silício limpo e seco com acetona a 100%, seguido de 100% de álcool isopropílico. Próximospin-coat-2 ml de GM1070 SU-8 fotoresistente (Gersteltec Sarl) sobre a bolacha em 3100 rpm durante 40 segundos para criar uma camada de 25 ^ M de espessura. A amostra é depois cozido numa placa quente a 65 ° C durante 5 minutos seguido por mais 5 min a 95 ° C.
3. Expor o material fotoresistivo SU-8 à luz UV durante 60 segundos sob uma fotomáscara com o padrão desejado (por exemplo, usando uma máscara alinhador Quintel Q6000) e repetir o processo de cozimento descrever em 2.2. Em seguida, a amostra é desenvolvido por imersão da bolacha em SU-8 revelador (Gersteltec Sarl) durante 4 minutos, lavadas em 100% de álcool isopropílico e secou-se sob um fluxo de azoto. A área do fotorresiste SU-8, que não foi exposta à luz UV é assim removido, criando o padrão inverso do carimbo de PDMS.
4. O próximo passo é para lançar um selo PDMS do mestre de silício. Em primeiro lugar, misturar 1 parte (w / w) do agente de cura com 10 partes de pré-polímero de elastómero (Sylgard 184). Para remover quaisquer bolhas de ar, desgaseifica-se a mistura num exsicador ligado a uma linha de vácuodurante 1 h. Em seguida, despejar o elastómero PDMS sobre o mestre de silicone dentro de uma placa de Petri com cerca de 1 cm de altura e curar a mistura principal e PDMS, em um forno a 70 ° C durante 1 h. Finalmente, o selo PDMS é removido do mestre de silício e cortadas à medida.

3. Estreptavidina padronização ou Cues adesivas em lamínulas PASSIVATED

Depois de passivação lamínulas, padrões de proteínas são impressos com impressão microcontact (3a Etapa) ou dip-pen litografia (Passo 3b). No nosso caso, a estreptavidina é impresso como linhas, que formam a base para gradientes de RGD (Passo 4). O mesmo procedimento pode também ser utilizado para a impressão de proteínas da matriz para criar padrões de adesivo.

Um método alternativo para a impressão microcontact para a modelação de biomoléculas sobre superfícies é dip litografia caneta. Na litografia dip caneta, um cantilever é usado para transferir um pequeno volume de solução sobre a superfície. O tamanho das consolas, viscosidade da solução, o tempo de contacto do cantilever sobre a superfície, a hidrofobicidade da superfície, e a humidade na câmara de impressão determinar o tamanho dos elementos impressos. A vantagem deste método é que os padrões diferentes podem ser impressos, para cada experiência, como não há necessidade de fabricar mestres e selos. A desvantagem é que demora mais tempo para imprimir um determinado padrão e que a litografia de imersão pena requer um instrumento especializado que pode não estar disponível em muitos laboratórios. O mergulho instrumento litografia caneta que usamos foi o NanoeNabler de Bioforce Nanociência. Aqui, é impresso pequenos pontos que eram <10 um de diâmetro, para o qual foi utilizado Spt10 consolas.

3a. Microcontact Técnica de impressão (μCP)

1. Para limpar e fazer o selo PDMS mais hidrofílica, o tratamento do lado modelado dos selos PDMS numa UV e ozono (por exemplo, a partir de Procleaner Ozone UV Bioforce Nanociência) durante 1,5 h. Em alternativa, utilizar um plasmaproduto de limpeza para um tempo mais curto para o mesmo fim. Este processo cria uma superfície oxidada PDMS ^24, o que melhora o processo de impressão.
2. Imediatamente após o tratamento com ozono ou plasma, o lugar e espalhar 10 uL de estreptavidina (1 mg / ml em PBS) para os carimbos de PDMS e deixar durante 1 hora numa câmara húmida (tal como um parcialmente cheio placa de 6 poços, ver Passo 1.3) . Se as faixas devem ser visíveis ao microscópio de fluorescência, utilizar estreptavidina que é conjugado com um fluoróforo tal como estreptavidina-AlexaFluor350.
3. Remover o excesso de estreptavidina o selo com papel de seda e secar o selo durante aproximadamente 1 min. Pressionar ligeiramente o selo para a lamela de vidro PLL-PEG-biotina-revestido.
4. Se fluorescente estreptavidina foi usado em 3.a2 etapa, examine o padrão utilizando sob um microscópio de epifluorescência. Armazenar as superfícies impressas em um dessecador.

3b. Dip litografia da pena

1. Em primeiro lugar, misturar 1 parte de 1 mg / ml de estreptavidina ou streptavidin-AlexaFluor350 com 10 partes de glicerol (v / v) e 5 ul de carregar a mistura para o cantilever. Em seguida, começa o processo de impressão, tal como descrito no manual de instruções do instrumento de litografia dip caneta. Para reduzir o tamanho da mancha de cerca de 5 um, ajustar a velocidade de impressão, o tempo de contacto do cantilever com a distância da superfície ou vertical do cantilever para a superfície. No exemplo mostrado na Figura 2c, os pontos foram impressos numa linha com linha e coluna de separação definida para 10-15 ^ m. Esta distância é suficiente para impedir que os pontos de fusão em si, mas permite a visualização de pontos múltiplos num único campo de visão do microscópio, com a maioria das configurações.
2. Armazenar as superfícies impressas em um dessecador.

4. Criando Gradientes adesivo na Estreptavidina padrão-Superfícies

Nós criar gradientes adesivas de biotina-RGD em lamelas de vidro que são revestidas com estreptavidina (Figura 3) ou copadrões ntain estreptavidina sobre lamelas de vidro passivado (Figura 5). Para criar um gradiente de superfície, foi utilizado um dispositivo comercialmente disponível de microfluidos (chamado pegajoso Slide-A quimiotaxia de Ibidi ^3D) que cria um gradiente de solução estável por difusão passiva. Para competir por sítios de ligação de estreptavidina, foram empregados dois gradientes opostos de biotina-RGD e biotina que não foi conjugada com RGD (ver Figura 1).

1. Respeite as lamelas de vidro revestidas com estreptavidina ou com estampas para o lado adesivo do dispositivo Quimiotaxia Slide-pegajoso ^3D. Para assegurar que não haja qualquer perda durante várias horas, as extremidades do dispositivo são selados com uma camada fina de vaselina aquecido e com uma segunda camada de uma mistura de 1 parte de vaselina para 1 parte de cera de parafina (w / w).
2. Encher o canal do dispositivo com 6 ul de PBS no canal. Em seguida, encher os dois reservatórios com 70 ul de 0,03 ug / uL biotina-4-fluoresceína em PBS e 70 & mu, l de 0,03 ug / uL biotina-RGD em PBS, respectivamente. Incubar as amostras à temperatura ambiente no escuro durante 1 hora.
3. Remover a solução de biotina e lavar cuidadosamente a superfície, enquanto ainda está ligado ao dispositivo de microfluidos por duas vezes com PBS. Marcar o sentido do gradiente de adesivo e, se necessário, o dispositivo de armazenamento cheio com PBS a 4 ° C para assegurar que, mas o dispositivo não seque. Se necessário, analisam o gradiente de adesivo com um microscópio fluorescente.

5. Rotulagem de células com fluoróforos para imagens de células vivas

As células são marcadas com corantes fluorescentes que auxiliam rastreamento de células sob um microscópio fluorescente. Sondas comuns são marcadores fluorescentes organelas, tais Syto 64 Vermelha, que rotula o núcleo da célula. Para fazer isso, as células são em primeiro lugar lavou-se três vezes com PBS, depois incubadas com 1 uM Syto Red 64 em meios de cultura durante 45 min e, finalmente, lavada mais três vezes com PBS. Por favor, note que as células não deve sermantidas em PBS por períodos de tempo longos.

Corantes alternativos para rastreamento de celular são séries CellTracker que manchar o citoplasma e são mantidas durante a migração e divisão celular. A transfecção de células com a proteína de fusão fluorescente é particularmente útil para registar a distribuição subcelular de uma proteína de interesse, durante a migração. No entanto, as proteínas fluorescentes tipicamente foto-branqueamento mais rápidos do que os corantes orgânicos de modo que as observações a longo prazo pode não ser possível.

6. Carregamento de células com um Gradiente solúvel no dispositivo Microf

1. Contar células marcadas por fluorescência e dividida em dois tubos de números de células iguais. Lavar e ressuspender um tubo de células com meio contendo a chemoattractant, tais como a modificação de Dulbecco, glicose baixa Eagle Médium (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS). Lavar e ressuspender o outro tubo de células em meio sem o quimioatractor, isto é DMEM com 0% de FBS. A concentração finalde células de cada tubo deve ser de 5 x 10 ⁵ células / ml.
2. Remova todas as soluções do dispositivo micro (do passo 4.3) e colocá-lo no palco microscópio (veja Passo 7). Carregar 70 uL de células ⁽⁵ x 10 5 células / ml em DMEM FBS 0%) em um reservatório e de 70 ul de células HeLa ⁽⁵ x 10 5 células / ml em DMEM 10% FBS) no outro. Frouxamente colocar uma fita sobre os reservatórios, para evitar evaporação. Se as células na superfície são pré-incubados antes da imagiologia, é aconselhável que as células são carregadas no dispositivo de meio de crescimento sem o gradiente. O dispositivo é então colocado sobre a platina do microscópio e os meios de comunicação substituído com gradiente meios ie DMEM sem FBS em um reservatório e DMEM com FBS a 10% na outra.

7. Viver imagens de células e Análise de Dados

1. Ligue o microscópio (Nikon Ti-E) e aquecer a fase de pelo menos 1 hora antes de começar a experiência.
2. Certifique-se de que o canal do microfluidic dispositivo está no campo de visão e as células estão no foco. Selecione o parâmetro de aquisição de imagem, tais como o tempo de exposição e filtros fluorescentes, seqüência de imagem de campo claro e fluorescência que captura células e faixas, bem como pontos de tempo e tempo de gravação (por exemplo, a cada 15 minutos para 16 horas).
3. Analisar os dados com softwares apropriados, como ImageJ manual de Rastreamento ou Quimiotaxia Ibidi e ferramenta de migração.

Resultados

Para compreender como a célula de integrar os sinais migratórios ^25, foi desenvolvido um método para células de imagem com a microscopia de fluorescência, que migram em um ambiente com concorrentes gradientes adesivas e solúvel (Figura 1). Faixas adesivas que continham estreptavidina fluorescente e RGD biotinilado foram criados com faixas microcontact impressos e mergulho litografia caneta (Figura 2). Impressão microcontact sucesso é indicado pela linha de perfil de intensida...

Discussão

Neste protocolo, foi utilizado um dispositivo disponível comercialmente microfluídicos (sticky Slide-Quimiotaxia ^{3D a} partir de Ibidi) para estudar os efeitos de superfícies quimicamente modificados e gradientes quimioatratantes sobre a migração celular. Esta instalação não requer microfluídico porque o gradiente de fluxo é estabelecido por difusão ao longo do comprimento do canal. Isto é importante porque o fluxo poderia afectar diferencialmente células migram lentamente, tais como fibroblastos, que formam e...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Coverglass manchando roupas Thomas	Scientific	8542 E40	Coverslip rack
Forno	Binder		ED 53 série
Wafer de silício	Silicon Quest	708-007	Boro dopado < 100> wafer, 4" de diâmetro, 500 μ m, polido de lado único
GM1070 SU-8 fotorresistente	Gersteltec Sarl
SU-8 revelador	Gersteltec Sarl
Sylgard 184 agente de cura	Dow Corning
Sylgard 184 pré-polímero de elastômero	Dow Corning
PLL-PEG-biotina (20%)	SuSos AG	PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotina (20%)	1 mg/ ml em PBS
Fluoresceína	Sigma	46955	1 mM em PBS
Estreptavidin-AlexaFluor350	Invitrogen	S-11249	1 mg/ml em PBS
Biotina-4-fluoresceína	Invitrogen	B-1370	0,03 μ g/μ l em
PBS Biotina-RGD	GenScript	SC1208	0,03 mg/ml em PBS
Syto 64 Red	Invitrogen	S-11346	1 μ M em PBS
Quimiotaxia de corrediça pegajosa 3D	Ibidi	80328
200 μ l Greiner ponta chanfrada amarela	Greiner Bio-One	739261
Vaselina	Sigma	16415
Cera de parafina, mp 55-57 ° C	Sigma	327204
Nano eNabler 10 μ m cantilever	BioForce	SPT-S-C-10s
Image J software	National Institute of Health		rsbweb.nih.gov/ij/download.html
Plugin de rastreamento manual	Fabrice Cordeliè res		rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html
Ferramenta de quimiotaxia e migração	Ibidi GmbH		www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html