Registro da atividade elétrica dos neurônios identificados no cérebro intacto de peixes transgénicos

Resumo

Neste vídeo, vamos demonstrar como para registrar a atividade elétrica dos neurônios individuais identificados em uma preparação do cérebro inteiro, o que preserva os circuitos neurais complexos. Usamos peixe transgênico no qual hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH) neurônios são geneticamente marcadas com uma proteína fluorescente para identificação na preparação cérebro intacto.

Resumo

Compreendendo a fisiologia da célula de circuitos neurais que regulam comportamentos complexos é muito maior usando sistemas de modelo em que este trabalho podem ser realizados em uma preparação cérebro intacto, onde o circuito neural do SNC permanece intacta. Usamos peixe transgênico no qual hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH) neurônios são geneticamente marcados com proteína fluorescente verde para identificação no cérebro intacto. Os peixes têm múltiplas populações de neurónios da GnRH, e as suas funções são dependentes da sua localização no cérebro e o gene de GnRH que expressam ^um. Nós nos concentramos em nossa demonstração GnRH3 neurônios localizados nos nervos terminais (TN) associados aos bulbos olfatórios usando o cérebro intacto de transgênicos medaka peixe (Figura 1B e C). Estudos sugerem que medaka TN-GnRH3 neurónios são neuromodulador, agindo como um transmissor de informação a partir do ambiente externo para o sistema nervoso central; they não desempenham um papel direto na regulação das funções hipofisário-gonadal, assim como o bem conhecido hipotálamo GNRH1 neurônios ^{2, 3.} padrão A tônica do potencial de ação espontâneo disparo de TN-GnRH3 neurônios é uma propriedade intrínseca ^4-6, a freqüência de que é modulada por pistas visuais de ^dois membros da mesma espécie e do neuropeptídeo Kisspeptin 1 ^5. Neste vídeo, usamos uma linha estável de transgênicos medaka em que TN-GnRH3 neurônios expressam um transgene contendo a região promotora de Gnrh3 ligado ao aumento da proteína verde fluorescente ⁷ para mostrar a você como identificar neurônios e monitorar a atividade elétrica em todo o cérebro preparação ^6.

Protocolo

1. Dissecação de cérebros de adultos Medaka

1. Anestesiar adulto do sexo masculino ou do sexo feminino (Figura 1A) por imersão em 5 ml MS-222 (150 mg / L, pH 7,4), aguarde alguns minutos após movimentos brânquias cessaram antes de decapitar. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use da Universidade da Califórnia-Los Angeles.
2. Decapitar o peixe em solução salina peixe na extremidade caudal do opérculo com uma tesoura em um diâmetro de 60 mm placa de Petri.
3. Transferência de cabeça de peixe até um diâmetro de 35 mm de uma placa de Petri, a metade cheio com solução salina e peixes revestida com Sylgard que tem uma depressão na mesma para posicionar e fixar a cabeça de dissecção cérebro. Posição e garantir a cabeça do lado dorsal com pinos de insetos.
4. Corte com cuidado a parte dorsal do crânio em torno do seu perímetro com uma tesoura fina e retire-o delicadamente com uma pinça, expondo a parte dorsal do cérebro, incluindo completamente a parte anterior da medula espinhal.
5. Levante a medula espinhal delicadamente com uma pinça de ponta fina e cortar os nervos conjuntivo bilaterais com uma tesoura de ponta fina: nervos cranianos, nervos espinhais e nervos ópticos no lado ventral do cérebro e dos nervos olfativos na parte anterior do o cérebro.
6. Coloque o cérebro totalmente dissecada em uma placa de Petri fresco preenchido com solução salina peixe e verifique cuidadosamente sob o microscópio para garantir todo o cérebro está intacto (incluindo a glândula pituitária), sem quaisquer cortes ou perfurações. Cérebros danificados, não são utilizados para a experimentação.

2. Montagem do cérebro em uma câmara de gravação

1. Colocar uma pequena gota de cianoacrilato ou algum outro tipo de cola de acção rápida com uma agulha no centro da câmara de registo e para espalhar a cola de cerca de 1 cm ^2.
2. Transferir rapidamente o cérebro e cola-lo em uma posição ventral up-side.
3. Adicionar 1 ml de solução salina de peixe de modo que ele preenche a câmara de registo e cobre o cérebro. Perfundir continuamenteo cérebro com salino gaseificado peixe a uma taxa de pelo menos 200 ul / min.
4. Usando a ponta fina forceps remover cuidadosamente as meninges sobre a superfície da área de gravação do cérebro.

3. Eletrofisiologia

1. Gravação remendo solto da ação potencial de queima
   1. Microeletrodos de vidro (6-10 mohms) são construídos a partir de pipetas de vidro de borosilicato (1B150F-4, Instrumentos de Precisão Mundial), utilizando um extrator de eletrodo (por exemplo, Sutter P-87), e de volta preenchido com a solução de gravação solta-patch no meio do caminho até o eletrodo.
   2. Usando um microscópio de fluorescência na posição vertical com a charge-coupled device refrigerado (CCD) da câmera, encontrar o GFP-expressando TN-GnRH3 neurônios através de 10x (Figura 1B), então os objetivos de imersão em água 40x (Figura 1C). Eles estão localizados em ou perto da superfície ventral dos bulbos olfativos, anteriormente ao telencéfalo.
   3. Mudar para um monitor de vídeo que está fornecendoimagens em tempo real a partir do microscópio para localizar o cluster neurônio TN-GnRH3 (Figura 1C).
   4. Posicionar o microeléctrodo no banho de modo que a ponta do eléctrodo está acima do neurónio alvo. Aplicar constante leve pressão positiva para o microeléctrodo de modo que ela não se torne obstruído, e aproximar-se suavemente o neurónio alvo com a ponta do eléctrodo.
   5. Controlar e monitorar a resistência do eletrodo no modo tensão-clamp usando software AxoGraph e amplificador Axoclamp 200B com software Axograph (Axon Instruments). Quando você pode ver a partir do monitor de vídeo que a ponta do eletrodo está na superfície do neurônio e da exibição de AxoGraph que a resistência muda um pouco, solte a pressão positiva e aplique uma ligeira pressão negativa se necessário, para fazer um selo de baixa resistência em neurônio (<100 mohms).
   6. Alternar para o modo atual-clamp, e registrar a tensão de membrana continuamente, sem qualquer entrada de corrente, ajustando a escalada tensão e da velocidade de gravação, se necessário. Os dados são coletados e analisados ​​por software Powerlab (ADInstruments Inc.).
   7. Actividade da ficha eléctrica da linha de base em solução salina normal para peixes cerca de 5 minutos antes de qualquer tratamento (Figura 2A). Banheira de perfusão de medicamentos, hormônios peptídeos, etc. adicionada a solução salina de peixe continua a uma taxa de 200 ul / min, seguido por um período de lavagem em solução salina normal, peixes ^{5, 6, 11.}
2. Gravação do potencial de membrana de células inteiras
   O adesivo de fixação procedimento electrofisiologia célula total é a mesma que a do processo de gravação solta-remendo extracelular acima descrito, a partir das etapas 3.1.1 - 3.1.4. Em seguida, os procedimentos de desviar de acordo:
   1. Controlar e monitorar a resistência do eletrodo no modo tensão-clamp. Quando você pode ver a partir do monitor de vídeo que a ponta do eletrodo está na superfície do neurônio e do osciloscópio que a resistência muda um pouco, solte o positivoaplicar pressão e um pouco de pressão negativa para fazer uma vedação de alta resistência no neurónio (~ 3 Giga Ω). Aplicar sucção suave pela boca a ruptura da membrana remendado, você vai ver uma queda brusca da resistência à cerca de 120-250 mohms.
   2. Alternar para o modo atual-clamp, e registrar a tensão de membrana continuamente, sem qualquer entrada de corrente, ajustando a escala de tensão e taxa de gravação, se necessário.
   3. Actividade da ficha eléctrica da linha de base em solução salina normal para peixes cerca de 5 minutos antes de qualquer tratamento, como acima descrito no 3.1.7 (Figura 2B).

Resultados

Um exemplo de grupos bilaterais de GFP marcadas com TN-GnRH3 neurónios do cérebro excisada de medaka peixes são apresentados nas Figuras 1B e 1C. Cada cluster contém cerca de 8-10 neurônios GnRH. As actividades neuronais espontâneas do destino TN-GnRH3 foram registrados no modo de corrente-braçadeira (I = 0), com taxas de queima típicas de 0,5-6 Hz. O padrão de ação potencial de queima é tipicamente um padrão tônico ou batendo, com um intervalo bastante regular interspike. Vestígios Exe...

Discussão

GnRH 3: GFP peixes transgênicos oferecem modelos exclusivos para estudar os mecanismos neurofisiológicos subjacentes à integração e regulamentação de controle central de comportamentos que estão direta e indiretamente envolvidos na reprodução ^{3, 8-10} neuronal. Uma das vantagens significativas deste sistema modelo é que muitas GnRH3 neurónios expressando GFP estão perto da superfície ventral do cérebro, o que permite um acesso relativamente fácil para os neurónios para o registo electrofisiológico sem...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Microscópio	Olympus		BX50W (Vertical)
Amplificador	Axon Instruments		Axoclamp 200B
Conversor A-D Computer	Interference Corp.		Digidata ITC-18
refrigerou a lâmpada	de Sensicam	da câmera PCO do CCD
	Instruments Co.
Conjunto de filtros GFP	Chroma Technologies
	imagem inteligente Inovações		de slidebook
Software de aquisição de dados de eletrofisiologia	Axon Instruments		Software de axógrafo
Software de aquisição de dados de eletrofisiologia	AD Instruments Inc.		PowerLab
Headstage para eletrofisiologia	Axon Instruments		CV 203BU
Micromanipulador	Sutter Instrument Co	MP-285
Recording Chamber Platform	Warner Instrument Corp.		Câmara de Gravação P1
	Warner Instrument Corp.		Extrator de Eletrodos RC-26G
	Instrumentos		Sutter P87
Filamento para extrator de eletrodos	Sutter Instruments	FB330B	3.0 mm de largura através do filamento
1.5 mm capilares de vidro	World Precision Instruments	1B150-4	Micr– lectrode para gravação
Seringa	Becton Dickinson	309586	3 ml
MS-222	Sigma	E10521-10G	Etil 3-aminobenzoato metanossulfonato sal
Salino			mM: 134 NaCl; 2,9 KCl; 2,1 CaCl2; 1,2 MgCl2; 10 HEPES
Solução de eletrodo (adesivo solto)			mM: 150 NaCl; 3,5 KCl; 2,5 CaCl2; 1,3 MgCl2; 10 HEPES; 10
glicose Solução de eletrodo (adesivo de célula inteira)			mM: 112,5 K-gluconato; NaCl; 17,5 KCl; 0,5 CaCl2; 1 MgCl2; 5 MgATP; 1 EGTA; 10 HEPES; 1 GTP; 0,1 leupeptina; 10 fosfo-creatina