Silenciando a longo prazo de Intersectin-1s nos pulmões do rato por entrega repetida de um siRNA específico via lipossomos catiônicos. Avaliação dos efeitos Knockdown por microscopia eletrônica

Cristina Bardita; Dan Predescu; Sanda Predescu

doi:10.3791/50316

Artigo de método

Silenciando a longo prazo de Intersectin-1s nos pulmões do rato por entrega repetida de um siRNA específico via lipossomos catiônicos. Avaliação dos efeitos Knockdown por microscopia eletrônica

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DOI:

10.3791/50316

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21 de junho de 2013

Cristina Bardita^*¹ , Dan Predescu^*¹^,² , Sanda Predescu¹^,²

¹Department of Pharmacology, Rush University, ²Pulmonary and Critical Care Department, Rush University

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Repetidas injeções de retro-orbital dos complexos liposomes/siRNA/ITSN-1s catiônicos em camundongos, a cada 72 horas por 24 dias, entregar eficientemente o duplex siRNA para a microcirculação do pulmão do rato reduzindo mRNA ITSN-1s e expressão da proteína em 75%. Esta técnica é altamente reprodutível num modelo animal, não tem efeitos adversos e evita mortes.

Resumo

Estudos anteriores mostraram que o knockdown de ITSN-1s (KD _ITSN), uma proteína envolvida na regulação de endocitose permeabilidade vascular pulmonar e células endoteliais (ECs) a sobrevivência, a morte celular induzida por apoptose, um obstáculo importante no desenvolvimento de um sistema de cultura celular, com períodos prolongados ITSN-1s inibição ^1. Usando lipossomas catiônicos como carreadores, exploramos o silenciamento do gene ITSN-1s nos pulmões do rato pela administração sistêmica de siRNA visando ITSN-1 gene _(ITSN siRNA). Lipossomas catiônicos oferecem várias vantagens para entrega siRNA: cofre com doses repetidas, não imunogénico, não tóxico, e fácil de produzir ^2. Lipossomas desempenho e actividade biológica depende do seu tamanho, carga, a composição lipídica, a estabilidade, a dose e via de administração ^{de 3} Aqui, eficiente e _ITSN KD específica em pulmões do rato foi obtida utilizando uma combinação de colesterol dioctadecil brometo de amónio e dimetil. Entrega intravenosade _ITSN siRNA / complexos de lipossomas catiônicos transitoriamente derrubado proteína ITSN-1s e mRNA em pulmões de ratos no dia 3, que se recuperou depois de mais 3 dias. Aproveitando os lipossomas catiónicos como um transportador segura repetível, o estudo alargado para 24 dias. Assim, o tratamento retro-orbital com complexos recém-gerados foi administrado a cada 3 dias, induzindo _ITSN KD sustentado ao longo do estudo ^4. Tecidos de camundongos coletadas em vários pontos tempo _ITSN pós-siRNA foram submetidos a análises de microscopia eletrônica (ME) para avaliar os efeitos da crônica KD _ITSN, no endotélio pulmonar. High-resolution EM imagens nos permitiu avaliar as alterações morfológicas causadas por KDITSN no leito vascular pulmonar (ou seja, o rompimento da barreira endotelial, diminuição do número de caveolae e regulação positiva de vias de transporte alternativos), características não-detectável por microscopia de luz. Em geral estes resultados estabeleceu um importantetante papel de ITSN-1s na função de ECs e homeostase do pulmão, enquanto que ilustra a eficácia da prestação de siRNA lipossomas in vivo.

Introdução

SiRNA Nu não pode penetrar na membrana da célula, a ser carregada negativamente, e que é facilmente degradado por enzimas no sangue, tecidos e células. Até recentemente, com modificações estruturais para melhorar a estabilidade, a acumulação de siRNA no local alvo depois da administração é extremamente baixo e requer um veículo intracelular eficiente ^5. Lipossomas catiónicos emergiu como seguros transportadoras ácidos nucleicos com o potencial de transferência de grandes pedaços de DNA / RNA em células, encapsulando e protegendo os ácidos nucleicos a partir da degradação enzimática ^6. Além disso, lipossomas catiónicos interagem espontaneamente c....