A especificação de telencefálicos neurónios glutamatérgicos de células-tronco pluripotentes humanas

Summary

Este procedimento gera os neurónios telencefálicos atravessando checkpoints que são semelhantes aos observados durante o desenvolvimento humano. As células são deixadas a diferenciar-se espontaneamente, são expostas a factores que os empurram no sentido da linhagem neural, são isolados, e são plaqueadas em lamelas de cobertura para permitir a diferenciação terminal e maturação.

Abstract

Aqui, um procedimento passo a passo para gerar eficientemente telencefálicos neurónios glutamatérgicos de células pluripotentes estaminais humanas (PSCs) tem sido descrita. O processo de diferenciação é iniciada quebrando as PSCs humanos em pedaços que completam-se para formar agregados quando as células são colocadas numa cultura em suspensão. Os agregados são então cultivadas em meio de hESC dias 1-4 para permitir a diferenciação espontânea. Durante este tempo, as células têm a capacidade de se transformar em qualquer uma das três camadas germinais. Dos dias 5-8, as células são colocadas num meio de indução neural para empurrá-los para a linhagem neural. Por volta do dia 8, as células são deixadas a ligar em placas de 6 poços e diferenciar tempo durante o qual a forma de células neuroepiteliais. Estas células neuroepiteliais pode ser isolado no dia 17. As células podem então ser mantidos como neuroesferas até que estejam prontas para serem semeadas em lamelas. Utilizando um meio de base sem quaisquer factores caudalizing, as células neuroepiteliais são specified em precursores telencefálicos, que podem então ser adicionalmente diferenciadas em células progenitoras dorsais e neurónios glutamatérgicos telencefálicos eficientemente. No geral, nosso sistema fornece uma ferramenta para gerar humanos neurônios glutamatérgicos aos pesquisadores para estudar o desenvolvimento desses neurônios e as doenças que os afetam.

Introduction

As células-tronco pluripotentes humanas (PSCs), incluindo tanto células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e as células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), têm a capacidade de gerar qualquer tipo de célula no corpo, incluindo neurónios ^1-3. Diferenciação dirigida de vários subtipos neuronais de PSCs humanos é a chave para a aplicação dessas células na medicina regenerativa. A geração de subtipos funcionais neuronais durante o desenvolvimento é um processo complexo, que envolve a indução da linhagem neuronal, a especificação de progenitores regionais ao longo do eixo rostro-caudal, e a diferenciação dos tipos de pós-mitóticos neuronais a partir dos....

Protocol

1. Geração de pluripotentes humanas Agregados de Células Tronco (D1-D4)

1. As células estaminais pluripotentes humanas são cultivadas em fibroblastos embrionários de ratinho (MEF) alimentadores na presença de meio de hESC suplementado com factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF, 4 ng / ml). Após 5-7 dias de cultura, quando as colónias são grandes, mas ainda não-diferenciada, eles estão prontos para o próximo passo.
2. A solução de enzima deve primeiro ser preparado. Num tubo de 50 ml, dissolve-se a dispase (ou colagenase) a uma concentração de 1 mg / ml em meio DMEM/F12. Uma vez que estas soluções misture melhor quando aquecido, colocar o tu....

Results

Aqui, um protocolo para diferenciar PSCs humanos em telencefálicos neurónios glutamatérgicos através de diversos passos críticos: a formação de agregados de PSC, a indução de células neuroepiteliais, a geração de células progenitoras telencefálicos, e a diferenciação terminal de células progenitoras em neurónios estes telencefálicos (Figura 1) possui foram descritos. Este sistema é robusto e eficiente na geração de células progenitoras telencefálicos e neurónios glutamatérgicos. Como um exemplo .......

Discussion

Existem vários passos cruciais durante o processo de diferenciação neuronal. É importante assegurar que as PSCs são pluripotentes humanas porque de outro modo as células podem já ser inclinado para tornar-se uma linhagem não-neuronal. Isto pode ser confirmado por coloração das PSCs humanos com anticorpos contra marcadores de pluripotência como Oct4, Sox2, Nanog e Tra-1-60 ^1-3. Se as PSCs humanos não dão muito bem após passaging deles, ROCK inibidor (Y27632) pode ser adicionado para ajudar. Para aqueles que tê.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Meio de águia modificado de Dulbecco com mistura de nutrientes F12 (DMEM/F12)	Gibco	11330-032
Knockout Serum Replacer	Gibco	10828-028
L-glutamina (200 mM)	Gibco	25030
Aminoácidos Não Essenciais	Gibco	1140-050
2-Mercapt– thanol (14,3 M)	Sigma	M-7522
Meio neurobasal	Gibco	21103-049
N2	Gibco	17502-048
B27	Gibco	12587-010
Heparina	Sigma	H3149
Bromidrato de poli-L-ornitina (poliornitina)	Sigma	116K5103
Laminina (humana)	Sigma	L-6274
Laminina (camundongo)	Invitrogen	23017-015
FBS	Gemini	100-106
Albumina de soro bovino (BSA)	Sigma	A-7906
Dispase	Gibco	17105-041
Collagenase	Invitrogen	17104-019
Accutase	Innovative Cell Tecnologias	AT104
ROCK Inibidor	Stemgent	04-0012
SB431542	Stemgent	04-0010
Dorsomorfina	Stemgent	04-0024
Fator de crescimento de fibroblastos 2 (FGF2, bFGF)	Invitrogen	13256-029
Inibidor de tripsina	Gibco	17075
0,1% gelatina	Anticorpo Millipore	ES-006-B
Foxg1	Dr. Y. Sasai
Anticorpo Hoxb4 (1:50)	Estudos de desenvolvimento Hibridoma Bank	I12
Pax6 anticorpo (1:5000)	Estudos de desenvolvimento Hybridoma Bank	PAX6
Nkx2.1 anticorpo (1:200)	Chemicon	MAB5460
Tbr1 (1:2000)	Chemicon	AB9616
anticorpo vGLUT1 (1:100)	Sistemas sinápticos	135302
Fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF)	PrepoTech Inc.	450-02
Fator neurotrófico derivado da glia (GDNF)	PrepoTech Inc.	450-10
Fator de crescimento de insulina 1 (IGF1)	PrepoTech Inc.	100-11
AMP cíclico (cAMP)	Sigma	D-0260
Sonic hedgehog (SHH)	R & D	1845-SH
Tubos de 50 ml	Becton Dickinson (BD)	352098
Tubos de 15 ml	BD	352097
Placas de 6 poços	BD	353046
Placas de 24 poços	Balões BD	353047
T25 (não tratados)	Balões BD	353009
T75 (não tratados)	BD	353133
Lamínulas	Chemiglass Life Sciences	1760-012
Placas de Petri de 6 cm	BD	353004
Pipetas de vidro de 9''	Filtros Fisher	13-678-20D
Steriflip (0,22 μ M)	Filtros Millipore	SCGP00525
Stericup 1.000 ml (0,22 μ M)	Millipore	SCGPU10RE
(Observer A1)	Zeiss	R2625
Incubadora de dióxido de carbono (Hera Cell 150)	da Thermo Electron Corporation
(Sterilgard III Advance)	Centrífuga The Baker Company
(5702 R)	Eppendorf