Fabricação de chips microfluídicos e método para detectar a gripe

Resumo

Um chip microfluídico integrado termoplástico tem sido desenvolvido para utilização como um diagnóstico molecular. O chip realiza a extracção dos ácidos nucleicos, a transcriptase reversa, e PCR. Os métodos para fabricar e executando o chip encontram-se descritos.

Resumo

Diagnóstico rápidos e eficazes têm um papel importante no controle de doenças infecciosas, permitindo que a gestão do paciente e tratamento eficazes. Aqui, apresentamos um chip microfluídico integrado termoplástico com a capacidade de amplificar vírus influenza A em paciente nasofaringe (NP), esfregaços e aspirados. Durante o carregamento da amostra do paciente, o dispositivo micro sequencialmente realiza on-chip a lise das células, purificação e concentração de RNA dentro da extracção em fase sólida (SPE), a transcrição reversa (RT) e de reacção em cadeia da polimerase (PCR), em câmaras de RT-PCR, respectivamente. Detecção do ponto final é realizada usando um Bioanalyzer off-chip (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Para os periféricos, utilizou-se uma bomba de seringa para dirigir reagentes e amostras, ao passo que dois aquecedores de película fina foram utilizadas como fontes de calor para a temperatura ambiente e as câmaras de PCR. O chip é desenhado para ser de camada única e adequado para o fabrico de elevado rendimento para reduzir o Fabricatiem tempo e custo. O chip microfluídico proporciona uma plataforma para analisar uma grande variedade de vírus e bactérias, limitado apenas pelas mudanças na concepção reagente necessários para detectar novos agentes patogénicos de interesse.

Introdução

Milhões de mortes foram relatadas durante os três pandemias de gripe do século 20 ^1. Além disso, a pandemia de gripe mais recente foi declarada pela Organização Mundial da Saúde (OMS) ^2, em 2009, e em 1 de agosto de 2010, 18.449 mortes foram registradas pela OMS ^3. Esta pandemia demonstrou mais uma vez a alta carga de doenças infecciosas, e da necessidade de rápida e precisa detecção de gripe para ativar a confirmação da doença rápida, resposta adequada de saúde pública e tratamento eficaz ^4.

Existem vários métodos utilizados para o diagnóstico da gripe, que incluem imunoensaios, ensaios rápidos antigénio directa fluorescente (DFA) e os métodos de cultura viral. Imunoensaios rápidos dramaticamente falta de sensibilidade ^5-8, enquanto que os outros dois métodos são muito trabalhosa e demorada ^9. Os testes moleculares oferecem múltiplas vantagens, incluindo um curto tempo de rotação SensIT, de altaivity, e maior especificidade. Várias entidades comerciais têm vindo a trabalhar no sentido rápidos testes moleculares (também chamados de testes de ácidos nucleicos ou NAT) para doenças infecciosas, e vários ensaios têm influenza em suas condutas. No entanto a maior parte deles necessitam off-chip de preparação da amostra. Nenhuma das alterações Clinical Laboratory Improvement (CLIA) renunciou testes moleculares incorporar a preparação da amostra para o cartucho de ensaio ou módulo.

Lab-on-a-chip desempenha um papel importante no desenvolvimento de dispositivos de point-of-care de teste. Após a introdução do chip primeira PCR, em 1993, ^10, numerosos esforços têm sido feito para desenvolver chips de teste de ácido nucleico. No entanto, apenas alguns deles têm a preparação da amostra integrado bruto com amplificação a jusante.

Temos anteriormente demonstrada a miniaturização de uma coluna de extracção em fase sólida (SPE) em um chip microfluídico plástico ¹¹ ea desenvolvermento e otimização de um contínuo fluxo de chip de PCR ^12. Aqui, nós estendemos o trabalho anterior para integrar a SPE com RT e as etapas de PCR em um único chip para diagnósticos clínicos e demonstrar a sua capacidade para amplificar ácidos nucléicos de paciente nasofaringe (NP), esfregaços e aspirados.

Protocolo

1. Fabricação de chips ¹²

1. Fazer duas placas de aglomerados Zeonex 690R: distribuir 8-9 gramas pelotas Zeonex uniformemente no centro de uma placa de metal, o pré-aquecimento na prensa aquecida a 198 ° C durante 5 min e, em seguida, aplicar a pressão lentamente até 2500 psi, durante mais 5 min. Para concluir esta etapa, foi utilizado um Carver imprensa quente.
2. Grava o canal microfluídico na placa com um molde de epóxi. Os detalhes sobre a fabricação do molde são descritos em outra parte ¹² (canal de desenho na Figura 2b): colocar uma placa sobre o molde epóxi; preaquecimento los na prensa aquecida a 157 ° C durante 10 min e, em seguida, aplicar a pressão lentamente até 1000 psi por mais 10 min . Remova a placa do molde à mão ou usando uma pinça, antes que esfrie. (Nota: usar luvas térmicas durante esta etapa.)
3. Perfura-se o chip em relevo, na entrada, a porta de resíduos, e a saída do canal microfluídico. Usamos um diâmetro de 1,25 mmeter broca para fazer os três orifícios.
4. Ligação do chip em relevo com uma outra placa (em cima): Lavar as fichas com IPA, RNAse Fora água desionizada e em sequência; ar seco e pré-aquecer-los na prensa aquecida a 131 ° C durante 10 min e em seguida pressionar a 350 psi para uma outra 10 min.
5. Anexar Nanoports na entrada, de resíduos, e as portas de saída separadamente usando JB Weld Epoxy; curar durante 15 a 24 horas de acordo com as instruções do fabricante.
6. Lavar o canal SPE com 50 ul RNAse Away, seguiu com 100 ul de água nuclease livre.
7. Carregar o canal de SPE com 4 ul de solução de enxerto (metacrilato de metilo, de 3% w / v de benzofenona) e, em seguida, a ligação cruzada de metacrilato, por incubação durante 10 minutos num forno de UV de comprimento de onda 365 nm sob UV e 2.000 mJ / cm ^2. Remover a solução residual com enxerto de vácuo. Utilizou-se o vácuo de parede. Para obter os melhores resultados, uma solução fresca deve ser usado. É geralmente aceitável, no entanto, para armazenar umsolução preparada a 4 ° C durante até uma semana.
8. Tornar a solução coluna SPE (todos% v / v): dimetacrilato de etileno de 16%, 24% de metacrilato de butilo, 42% de 1-dodecanol, ciclohexanol 18%, e adicionar 1% de 2-dimetilamino-4-(metil-f enilamino)-fenol como o foto-iniciador.
9. Retire o mesmo volume de solução de sílica microesferas como sendo a solução da coluna SPE (para fazer uma mistura a 1:1), e secá-la completamente, a 70 ° C durante a noite num forno de vácuo. Quebra-se o pellet tocando o tubo com a tampa fechada. Adicionar a solução da coluna SPE dentro do tubo de sílica seco de microsferas e vortex para misturar.
10. Carregar 4 ul de solução de SPE no mesmo canal e, em seguida, formar ligações cruzadas por radiação UV é de 2,5 min. Em seguida, vire o chip de uma e outra irradiar para 2,5 min. A coluna de SPE polimerizada deve ser um sólido opaco branco.
11. Lavar o canal com 500 ul de metanol a 100% para enxaguar o excesso de reagentes. Esta lavagem remove também intra-polímero posolventes rogenic, criando desse modo a estrutura de poros abertos da coluna SPE, após secagem em condições ambientes.
12. Anexar dois aquecedores de película fina para o fundo do chip com a fita condutora térmica. Os lados dos aquecedores têm de estar alinhadas com a borda dos canais largos para desnaturação e recozimento separadamente (ver Figura 1).
13. Coloque cinco termopares no chip através da morte terminou canais laterais abertas de cada chip (ver Figura 2b). Os termopares ficar nestes canais via ajuste de imprensa. Fita foi utilizada para continuar a fixar a localização dos termopares.

2. Método de Extracção em Fase Sólida

1. Preparar 96 ul de etanol a 70%, com água tratada com DEPC e autoclavadas (desionizada ou Millipore-filtrada).
2. Adicionar 4 de ul de RNA 25X Fixe a 96 ul de etanol a 70% em um tubo, e duplicar a mesma mistura com 100% de etanol, num tubo separado.
3. Prepare 300ul de tampão de canal através da mistura do seguinte: 75 jul de tiocianato de guanidina 6 M (GuSCN), 150 ul de 2-propanol, 63 ul de água livre de nuclease, e 12 ul de RNA 25X seguros.
4. Preparar 312 ul de tampão de lise por mistura de: 100 uL de 6 M GuSCN, 200 ul de 2-propanol, e 12 ul de RNA 25X seguros.
5. Aquece-se a etanol a 70%, etanol a 100% de tampão de canal, e tampões de lise a 60 ° C durante 10-20 min para ativar o Secure RNA.
6. Para equilibrar o canal microfluídico, execute o buffer de canal através do canal de SPE com um caudal de 0,8 ml / hr.
7. Quick-descongelar a amostra de teste em VTM a 37 ° C em banho de água, e remover a amostra do banho de água imediatamente, logo que ele é descongelado.
8. Centrifugar amostra a 13.000 rpm durante 10 min, e transferir 100 ul do sobrenadante para 300 ul de tampão de lise. Completa a mistura por adição de 6 ul de 1 ug / ul de ARN transportador.
9. Vortex para misturar, e após centrifugação para5 seg, carregar o lisado inteiro para uma seringa Luer-lok cc 1.
10. Executar lisado através do canal de SPE com um caudal de 0,8 ml / hr.
11. Lava-se a canal de SPE com 100 ul de etanol a 70%, seguido de 100 ul de etanol of100% a 1 ml / hr. (Há um volume de 50 ul morto na ponta da seringa que não será empurrada para fora, então na verdade apenas 50 ul está a atravessar o canal.)
12. Posicionar uma seringa vazia na marca de 0,5 ml e empurrar o ar através do canal para secá-la, a 1 ml / hr.
13. Executar 67,5 ul de água livre de nuclease através do canal para eluir os ácidos nucleicos ligados a 0,5 ml / h, e recolher 13,5 uL da nanoport no porto de resíduos. (A perda de líquidos é devido ao volume de 54 ul morto na ponta da seringa e o canal de SPE.)

3. RT-PCR

1. Prepare 36,5 uL da mistura principal de RT-PCR durante o passo de ar seco (2,12), utilizando os reagentes em um OneStep RT-PCR Qiagen kits.
2. Carregar RT-PCR reagente no nanoport no porto de resíduos, e mistura-se com o RNA para obter a seguinte reacção 50 uL de RT-PCR: 13,5 ul de RNA eluído em água livre de nuclease, 4 ul de mistura de RT-PCR de enzima, solução de 10 ul de Q, 10 μl1X um tampão passo, 2 mM de MgCl ₂ 25 uL, 1 ul de 50 mM de primer forward 5'-GAC CRA TGT TCC CAC CTC TGA C-3 ', 1 ul de 50 mM de iniciadores inverso 5'-TGG AGG GCA TTY ACA AAK CGT CTA-3 ', 2 ul de dNTPs, 0,75 ul de 1,0% w / v de BSA, 0,73 e 5,02 ul de água PEG8000 nuclease ul livre.
3. Coloque a mistura de RT-PCR para o canal de RT por vácuo suave (utilizou-se o vácuo de parede) e selar o Nanoport com um encaixe fechado.
4. Aplicar 35 V para o aquecedor 1. Manter os reagentes no canal de RT, durante 30 min, após o aquecedor 1 equilibra a 50 ° C. Manter os reagentes no canal de RT, durante 15 min, após o aquecedor uma equilibra a 95 ° C.
5. Aplicar 27 V para o aquecedor 1 e 50 V para o aquecedor 2, esperar cerca de três minutos ou até que um aquecedor equilibra a 60 e deg, C e aquecimento 2 equilibra a 95 ° C.
6. Empurrar os reagentes para dentro do canal de PCR com 0,5 ul / min. Deve ter cerca de 20 min para os reagentes fluir através do canal de serpentina.
7. Como a amostra torna-o no final do canal de serpentina, recolher os produtos de PCR na saída utilizando um pipetador de tamanho adequado e de ponta.

4. Detecção de Produtos PCR

1. Usamos um Agilent teste de DNA de alta sensibilidade para detectar os produtos. Para executar este teste tirar a Agilent Kit DNA Alta Sensibilidade da geladeira 30 minutos antes do teste.
2. Ligue o Bioanalyzer e abra o software especialista 2100.
3. Carregar o 1 uL dos produtos de PCR para o ensaio e seguir o protocolo Agilent ( http://gcf.pbrc.edu/docs/Agilent/Agilent 20Manual.pdf% ).
4. Analisar e registrar os dados.

Resultados

Um resultado típico é mostrado na Figura 3, para uma amostra de influenza A lavagem nasofaríngeo infectado. Devido às diferentes quantidades de vírus influenza em cada amostra de paciente, a concentração final de produto de PCR pode variar. Um bom resultado deve ter baixo ruído, dois picos escada claras (35 e 10380 pb) e um pico único produto com o tamanho do produto concebido (107 pb) para a amostra positiva. Enquanto que o pico do produto deveria, teoricamente, estar ausente dos controlos negati...

Discussão

O método de diagnóstico aqui apresentados demonstram a capacidade de um chip microfluídico integrado plástico para amplificar influenza A RNA a partir de amostras de pacientes com elevada especificidade e um limite de detecção de baixo ¹³ Concebemos este chip para o ponto de teste de potencial cuidado:. (A) a temperatura do fluido e controle foram simplificados, (b) o chip é de baixo custo e conveniente para a fabricação de alto rendimento usando moldagem por injecção, e (c) o chip é descartável e destinado a...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente / Material	Companhia	Número de Catálogo
1-dodecanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	443816-500G
2,2-dimetoxi-2-fenilacetofenona	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	196118-50G
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies, Santa Clara, CA	G2943CA
2-Propanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	19516
Benzofenona	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	239852-50G
BSA	Thermo Fisher Scientific, pittsburge, PA	A7979-50ML
Metacrilato de butilo	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	235865-100 ml
RNA Transportador	Qiagen, Valencia, CA	1017647
Ciclohexanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	105899-1L
Etanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	E7023
Dimetacrilato de etileno	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	335861
Dimetacrilato de etilenoglicol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	335.681-100ML
Seringa de vidro de 250 jil	Hamilton, Reno, NV	81127
Tiocianato de guanidina	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	50981
Kit DNA Alta Sensibilidade	Agilent Technologies, Santa Clara, CA	5067-4626
Prensagem a quente	Carver, Wabash, EM	4386
JB Weld Epóxis	McMaster-Carr, Elmhurst, IL	7605A11
Luer-Lok seringas	BD-Medical, Franklin Lakes, NJ	309628
Cloreto de Magnésio	Thermo Fisher Scientific, pittsburge, PA	AB-0359
Metanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	494437
Metacrilato de metilo	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	M55909
Nanoport	Upchurch Científico	N-333-01
Nanoport Fitting	Upchurch Científico	F-120x
Água livre de nuclease	Thermo Fisher Scientific, pittsburge, PA	PR-P1193
OneStep RT-PCR Kit	Qiagen, Valencia, CA	210210
PEG8000	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	41009
Fonte de alimentação	VWR, Radnor, PA	300V
RNAse Fora	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	83931-250ML
RNASecure	Applied Biosystems, Foster City, CA	AM7005
Sílica microesferas	Polysciences, Warrington, PA	24324-15
Bomba de seringa	Harvard Apparatus, Holliston, MA	HA2000P/10
Tape termicamente condutiva	McMaster-Carr, Elmhurst, IL	6838A11
Par termoelétrico	Omega Engenharia, Stamford, CT	5SRTC-TT-J-40-36
Película fina Aquecedores	Minco, Minneapolis, MN	HK5166R529L12A
Crosslinker ultravioleta	UPV, Upland, CA	CL-1000
Zeonex	Zeon Chemicals, Louisville, KY	690R