Summary
В миография давления, нетронутым небольшой сегмент судне установлена на двух небольших канюли и давлением до подходящего просвета давления. Здесь мы описываем метод измерения вазорелаксацию реакция мыши 3
Abstract
Системы под давлением миографа изысканно полезным в оценке функциональной мелких артерий, давление до подходящей трансмуральная давления. Рядом физиологическое состояние достигается давления миография позволяет углубленный характеристику внутренней ответов на фармакологических и физиологических стимулов, которые могут быть экстраполированы на поведение в естественных условиях сосудистого русла. Давление миографа имеет ряд преимуществ по сравнению с обычными myographs проволоки. Например, мелкие суда сопротивление может быть учился в жестко контролируется и физиологически значимых внутрипросветные давления. Здесь мы изучаем возможность 3-го порядка брыжеечных артерий (3-4 мм длиной), с preconstricted фенилэфрин, чтобы сосудосуживающих расслабиться в ответ на ацетилхолин. Брыжеечной артерии установлены на двух канюли соединен с давлением и закрытой системе, которая поддерживается при постоянном давлении 60 мм рт. Просвет и внешний диаметр сосуда continuouхитрый, записанные с помощью видеокамеры, позволяющий в реальном количественного время вазоконстрикции и расширение сосудов в ответ на фенилэфрин и ацетилхолин, соответственно.
Чтобы продемонстрировать применимость давление миография для изучения этиологии сердечно-сосудистых заболеваний, мы оценили эндотелий-зависимой сосудистой функции в мышиной модели системной гипертензии. Мыши, дефицитные по α 1 субъединицы растворимой гуанилатциклазы (sGCα 1 - / -) являются гипертоническая когда на 129S6 (S6) фоне (sGCα -/-S6 1), но не тогда, когда на C57BL / 6 (B6) фоне (sGCα 1 -/-B6). Использование давления миография мы покажем, что 1-sGCα дефицит приводит к нарушению эндотелий-зависимой расширение сосудов. Сосудистая дисфункция является более выраженным в sGCα 1 -/-S6, чем в 1 sGCα -/-B6 мышей, вероятно ВКЛАДнг до более высокое кровяное давление в sGCα 1 -/-S6, чем в 1 sGCα -/-B6 мышей.
Давление миография является относительно простым, но чувствительным и механистически полезный метод, который может быть использован для оценки влияния различных раздражителей на сосудистый сокращение и расслабление, тем самым увеличивая наше понимание механизмов, лежащих в основе сердечно-сосудистых заболеваний.
Introduction
Системы под давлением миографа используются для измерения физиологических функций и свойств малых артерии, вены и других судов. Нетронутым небольшой сегмент артерии или вены установлена на двух небольших канюли стекла и давление повышают до подходящего просвета давления, позволяя сосуд для поддержания большей части в естественных характеристик (фиг. 1 и 2). Рядом физиологическое состояние у давлением миографа отражает в естественных условиях поведение сосудистого русла, что позволяет исследование внутренних свойств (например, миогенной тона) изолированных сосудов. Некоторые из преимуществ давление миография над провод миография, где сокращение мышц оценивается путем прямого механического соединения с динамометрическим датчиком 1, включают (I), что микро сопротивление артерий, которые определяют общее сопротивление разработаны в сосудистой системе, могут быть изучены, в то время провод миографа ограничивается трубопровод большого диаметра артерии, (II) тшапка риска повредить эндотелий уменьшается, поскольку провода не нужно проходить через просвет сосуда, (III), что естественные формы сосуда лучше поддерживается, и (IV), что судно измерение может быть изучена в широком диапазоне давления или напряжения сдвига 2.
Изучение микро сосуды могут быть более информативными, чем изучение больших артерий трубопровода, чтобы помочь понять патофизиологии и молекулярные механизмы, которые способствуют измененный сосудистый тонус сердечно-сосудистых заболеваний, таких как гипертония. Например, нарушение функции эндотелия, связанных с кормлением мышей высоким содержанием жиров в течение 8 недель может быть продемонстрировано во 2-й порядка брыжеечных артерий 3, но не в аортального кольца (рис. 3). Еще одно преимущество миография давления является то, что внутренние миогенном сужение сосуда под давлением присутствует, и что роль и функции эндотелия в этом явлении могут быть изучены. Здесь мы DescrIBE использования давления миографа для изучения реактивности сосудов мыши брыжеечной артерии 3-го порядка сопротивление в условиях нарушенного оксида азота (NO)-цГМФ сигнализации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Получение раствора
- 500X ЭДТА складе: весит 500 мг ЭДТА-Na 2 • 2H 2 O и растворить в 50 мл деионизированной воды. Хранить при комнатной температуре.
- KCl деполяризующие решение.
- Подготовьте K10X раствора: 3,69 г NaCl, 18,64 г KCl, 0,36 г безводного MgSO 4, 0,41 г KH 2 PO 4, 0,46 г CaCl 2 • 2H 2 O. Растворите в 250 мл деионизированной воды. Хранить при комнатной температуре.
- В 100 мл конечного деполяризующего раствора KCl 1X: растворите 0,21 NaHCO 3, 0,18 г глюкозы в 90 мл деионизированной воды. Добавить 10 мл раствора K10X. Добавить 95 мкл раствора 500Х ЭДТА. Хорошо перемешать. Хранить при температуре 4 ° C. Использовать в течение одной недели.
- Подготовка свежих HEPES-PSS решение на день эксперимента (за 1 литр).
- 6,96 г NaCl, 0,35 г хлорида калия, 0,288 г MgSO 4 • 7H 2 O, 0,1605 г KH 2 PO 4, 2,38 г HEPES. Растворите в 100 млдеионизированной воды. Взять колбу А.
- 0,312 г CaCl 2 • 2H 2 O. Растворить в 100 мл деионизированной воды. Отметить как колбу B.
- 1,25 г NaHCO 3, 0,991 г глюкозы. Растворить в 98 мл деионизированной воды. Отметить как колбу C.
- Добавить 2 мл 500X ЭДТА в колбе C. Возьмите 700 мл деионизированной воды в большой колбе. Налить содержимое колбы A, B и C в большой колбе с непрерывным встряхиванием. Доводят рН до 7,4 с помощью NaOH.
2. Препараты, применяемые
- Фенилэфрин (10 -2 М): растворите 20,37 мг в 10 мл деионизированной воды. Алиготе 1 мл и хранят при температуре -80 ° С. Серийно разбавить до получения 10 -3 10 -4 10 -5 и 10 -6 моль / л в день эксперимента.
- Ацетилхолин (10 -2 М): растворите 18,17 мг в 10 мл деионизированной воды. Алиготе 1 мл и хранят при температуре -80 ° С. Серийно разбавить до получения 10 -3 10 -4 10 -5 и 10 -6моль / л в день эксперимента.
3. Мыши
Мужской WT и sGCα 1 - / - мышей на S6 и B6 фоне были изучены в настоящем исследовании. SGCα 1 - / - были получены, как описано выше 4,5. Жилищного строительства и процедуры, связанные с экспериментальных животных (мышей) были одобрены подкомитетом по исследованиям животных Уход за Massachusetts General Hospital, Бостон, Массачусетс.
4. Измерение сосудистую реактивность в брыжеечная артерия
- Эвтаназии мышей пентобарбиталом (200 мг / кг, внутрибрюшинно). Откройте брюшной полости и Рассеките из брыжеечной ткани. Изолировать и анализировать брыжеечной артерии 3-го порядка бесплатно соединительной и жировой ткани и поместите артерии в ледяной HEPES-PSS решение предварительно уравновешенную 95% O 2/5% CO 2 в течение 15 мин. Cut кольца 2-3 мм длиной, не отходящих от брыжеечныхартерии. Дифференциация между артериями и венами на микроуровне суда является проблематичным, когда нет крови в сосудах. Поэтому мы рекомендуем выявления судна, пока он еще нетронутым в животном Перед рассмотрением его.
- Наполните стаканчик канюли в напорной камере миографа (DMT Модель 110P и 11P версии 1.31, рисунок 2) с HEPES-PSS раствор с помощью 10 мл шприц через впускные и выпускные клапаны. Заполнение канюли должно быть сделано аккуратно и тщательно, как чрезмерное давление может повредить хрупкую преобразователь подключен к канюли. После заполнения канюли закрыть оба впускных и выпускных клапанов плотно.
- Установите один конец сосуда на правой канюли и тщательно связать его с одним мелкий нити из нейлона шва. С помощью шприца, промыть и заполнить сосуд с HEPES решение через впускной клапан. Привести в левой канюли ближе к судну и смонтировать на другом конце судне на него. Связывайте его с нейлоновой ниткой. Заполнениекамера с до 10 мл с раствором HEPES. Проверьте наличие утечки осторожно нажав HEPES решение через впускной клапан при помощи шприца.
- Установите камеру на миографа и под видеокамеру. Запустите кислорода и тепла (37 ° С) в камере. Соединение впускного клапана с трубкой Р1 из первого резервуара раствор HEPES, когда клапан закрыт. Пусть каждый пузырь и решения проходят через трубку, пока нет никаких пузырьков в трубке. Откройте клапан.
- Подключите левый клапан камеры с трубкой P2 Исходя из регулятора давления. Снова проверьте, нет ли пузырьков. Там не должно быть никаких пузырьков или утечки в системе в целом.
- К давлению меню на мио-интерфейс панели или в программном обеспечении и включить насос при включении подачу.
- Откройте программу и нажмите кнопку Collect. Судно следует рассматривать на экране сейчас (рис. 3). Судно визуализируется с камерой установлены на микроскопе, позволяя Monitoriнг и анализ просвет сосуда, диаметр сосуда, и толщины стенки.
- Постепенно вводите interluminal давления через клапан P1, выбрав давление Р1 в мио-интерфейс панели или в программу и введите значение давления следующим образом: 5 мм → 10 → 20 → 40 → 60 мм рт. Судно имеет тенденцию когда-нибудь крутить или свертки в то время как давление растет; регулировки натяжения или напряжения соответственно с помощью вертикальных или продольных микроподвижки (рис. 2). Равновесие сосуде при 60 мм рт.ст. и 37 ° С по крайней мере в течение 45 мин. Изменение раствор ванны один раз подогретого HEPES при уравновешивания.
- Применяют 10 мл деполяризующего раствора KCl, предварительно нагретой при 37 ° С в ванну, чтобы полностью деполяризации клеток гладких мышц и достижения максимального сужения. После стабильного сужения, промыть ванну с HEPES раствора 3 раза каждые 10 мин.
- Проверка жизнеспособности судна и целостности эндотелия стабильным и репродуктивногоIBLE ответов на добавлением фенилэфрина (10 -5 М) и ацетилхолин (10 -5 М). Промыть 3 раза HEPES раствора каждые 10 мин.
- Добавить фенилэфрина (10 -5 М) в preconstrict судна, и при стабильном сужение был получен, выполнение совокупный концентрации сосудов кривая отклика (CRC) последовательным добавлением увеличением дозы ацетилхолина (10 -9, 3 х 10 - 9, 10 -8, 3 × 10 -8, 10 -7, 3 × 10 -7, 10 -6, 3 × 10 -6, и 10 -5 М). После последней дозы, промыть 3 раза раствором HEPES каждые 10 минут, прежде чем начать новую CRC.
- Определить диаметр просвета пассивным путем применения Ca 2 +-Free PSS, содержащем 2 мМ ЭДТА. Из записанных мере обводка диаметр просвета для каждого доза-ответ (рис. 4), который будет использоваться для расчета всех параметров.
- Выразить все ответы ацетилхолина релаксации, PERCentage изменение диаметра просвета после фенилэфрина preconstriction по сравнению с разностью между бескальциевой диаметра и диаметра после фенилэфрина сужение, используя следующее уравнение:
- Процент расширение = 100% х [(D х - D I) / (D Ca-Free - D I)], где D является измеренный диаметр просвета и X, I и Са-Free обозначают артериальную диаметров при каждой дозе агониста (х), начальное следующего диаметра фенилэфрин сужения (I), а в Ca 2 + буфере (CA-бесплатно).
5. Статистический анализ
Все непрерывных измерений представлены в виде среднего ± SEM. Сосудистую реактивность в брыжеечных артерий анализируется повторных измерений двусторонний ANOVA. Во всех случаях Р <0,05 считают статистически значимым.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
НЕТ центре участвуют в поддержании гомеостаза крови давление как у человека 6 и на животных моделях 7. Способность NO контролировать сосудистую релаксацию гладких мышц опосредована растворимой гуанилатциклазы (рГЦ), гем-содержащих Гетеродимерный фермент, который генерирует цГМФ 8. Недавно кровяное давление модифицирующие генетический вариант был идентифицирован в локусе, который содержит sGCα 1 и sGCβ 1 гены, иллюстрирующие значимость рГЦ в регуляции кровяного давления у людей 9. Интересно, что мужской мышей, дефицитных по α 1-субъединицу рГЦ (sGCα 1 - / -) являются гипертонической когда на 129S6 (S6) фона (sGCα 1 -/-S6) 5, но не тогда, когда на фоне C57BL / 6 (В6) (sGCα -/-B6 1) 4. Мы использовали давление миография для изучения сосудистой релаксации в ответ на ацетилхолин в брыжеечных житеПозиция артерий изолированы от WT и sGCα 1 - / - мышей на S6 и B6 фоны и preconstricted с фенилэфрина (рис. 4). Мы изучали сопротивление артерий, потому что они определяют конечную сопротивления и соблюдения сосудистой системы и, следовательно, непосредственно регулируют кровяное давление. sGCα 1-дефицитной было связано со снижением способности cetylcholine чтобы вызвать сосудистой релаксации, независимо от генетического фона мышей изучали (фиг. 4 и 5). Тем не менее, эндотелий-зависимой релаксации было более заметно нарушается в sGCα 1 - / - мышей на фоне S6, чем в sGCα 1 - / - мышей на фоне B6 (рис. 5) 10. Все вместе эти результаты показывают, что снижение чувствительности сосудистой эндотелиальной-зависимой релаксации может способствовать штаммоспецифической гипертензии у рГЦ и Alph, 1 - / - мышей.
Рисунок 1. Схематическое изображение различных частей давление миографа камеры (DMT). Вставке показан смонтированный судов канюли в камере. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 2. Представитель изображения, снятого при записи, из 2-го порядка мыши брыжеечная артерия под (A) и базального (B) фенилэфрина индуцированных сужения. Наружный диаметр и просвет сосуда очерчены зеленой и красной линиями соответственно. Следы в правой панели представляют собой интенсивность сигнала, измеренные в арEA определяется синей коробке в изображениях на левую, для наружного диаметра (зеленые стрелки) и диаметр просвета (красные стрелки).
Рисунок 3. Эндотелиальной дисфункции у мышей, которых кормили с высоким содержанием жиров в течение 8 недель не было очевидным в кольцах аорты. Эндотелиальной функции измеряли расширение сосудов ответа, индуцированного ацетилхолином (10 -9 до 10 -5 М) в фенилэфрина (10 -5 М), предварительно -контракт аортального кольца. Стандартной диете, дикого типа мышей кормили стандартной диетой (п = 8); высоким содержанием жиров, у мышей дикого типа диете с высоким содержанием жиров в течение 4-6 недель (п = 13).
Рисунок 4. Представитель оригинальных начертаний кривую ацетилхолина на фенилэфрином proconstricted 2-го порядка тesenteric артериях изолирован от WTB6 (А) и sGCα 1 -/-S6 мыши (B). Стрелки обозначают совокупный того возрастающих доз acetycholine (10 -9 до 10 -5 М). По оси абсцисс время (в секундах), ось Y представляет диаметра просвета (в мкм). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 5. Штаммоспецифической гипертензии у sGCα 1 - / - мышей связано с большими нарушениями реактивности сосудов в sGCα 1 -/-S6 мышей, чем в 1 sGCα -/-B6 мышей способность ацетилхолина (10 -9 до 10 -5. ) для расслабления количественно в фенилэфрин-Precontracted (10 -5 М) брыжеечных артерий от мужского дикого типа (WT, закрашенные символы, сплошная линия) и sGCα 1 - / - (открытая symbnols, пунктирная линия) на мышах B6 (кружки) или S6 (квадраты) генетического фона . Acetycholine индуцированной релаксации сосудистой нарушается в большей степени в sGCα 1 -/-S6 чем в sGCα 1 -/-B6 мышей. N = 3,5,3 и 6 для sGCα 1 -/-S6, sGCα 1 -/-B6, WTS6 соответственно. † * Р <0,05 по сравнению с sGCα 1 -/-B6, P <0,05 по сравнению с sGCα 1 - / - одного и того же генетического фона. Адаптированном виде покупает, и соавт. (2012).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мыши являются экспериментальной моделью выбора для многих исследователей, в частности, из-за возможности введения генетических модификаций, тем самым генерируя модели мыши для человека патофизиологии. Вазоактивных статуса малым сопротивлением, но не более крупных сосудов канала в значительной степени определяет регулирование потока крови в течение сосудистой системы 11. Размер сопротивление артерий в небольших животных, таких как мыши, позволяет использовать провод миографа изучать микрососудистой функции. Давление myographs не только преодолеть это ограничение, но также позволяют для измерения функции сосудов под рядом физиологических условиях.
Ранее мы сообщали, что самцы мышей дефицит sGCα 1 являются гипертоническая когда на 129S6 (S6) фоне (sGCα -/-S6 1) 5, но не тогда, когда на C57BL / 6 (B6) фоне (sGCα -/-B6 1) 4. Мы предположили, что это споезд связанных различий в кровяное давление из-за различий в реактивности сосудов между sGCα 1 - / - мышей на B6 и S6 фона. Использование давления миографа, мы изучали эндотелий-зависимой ответов вазорелаксацию в артериях 3 го порядка брыжеечных. Ацетилхолин является мускариновым агонистом рецептора, который связывается с рецептором в эндотелии, чтобы активировать эндотелиальной синтазы оксида азота (Енос) через увеличение внутриклеточной концентрации Са 2 +. Нет Можно впоследствии активировать рГЦ в базовой гладким слоем мышечных клетках для расслабления.
Использование давления миография сравнить способность эндотелиальных полученных НЕТ vasorelax брыжеечных артерий изолированы от WT и sGCα 1 - / - мышей на S6 и B6 фона, мы выявили различия в реактивности сосудов между sGCα 1 - / - мышей на B6 и S6 10 фонов. sGCα 1 -Дефицит был связан с нарушением эндотелий-зависимой вазорелаксацию в обоих S6 и B6 мышей. Тем не менее, это нарушение было больше в sGCα 1 -/-S6, чем в 1 sGCα -/-B6 мышей. Снижение способности ацетилхолина, чтобы вызвать расширение сосудов в S6 мышей вероятностью вносит свой вклад в повышение артериального давления наблюдается в sGCα 1 -/-S6 мышей, но не в sGCα 1 -/-B6 мышей. Несмотря на то, повышенное кровяное давление часто связывают с почечной аномалии 12, эти результаты усиливают возникающие гипотеза, что первичные аномалии сосудистого тонус гладких мышц, например, связанных с нарушением NO-цГМФ сигнализации 10,13, могут непосредственно способствовать развитию системной гипертензии 14.
В заключение, техника миографа давление является очень мощным инструментом в руках сосудистой физиолог и фармаколог или может бэлектронной использованы для анализа микро функцию сосуда. Наше исследование свидетельствует о применимости давления миография в выявлении основных сосудистые аномалии в модели системной гипертензии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить д-ра. Павел и Дмитрий Хуан Atochin для использования ДМТ давления миографа и доктора. Binglan Ю и Чонг леев за предоставление мышей, которых кормили с высоким содержанием жиров или стандартной диете.
ИСТОЧНИК ФИНАНСИРОВАНИЯ
Эта работа была поддержана ученым грантов на цели развития 10SDG2610313 от Американской ассоциации сердца (в ES Покупать) и Элеонора и Майлз Шору 50-летию программы стипендий для ученых в области медицины из Гарвардской медицинской школы (для ES Покупать).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358 | |
| CaCl2 (2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M65-500 | |
| KH2PO4 | Sigma | P3786 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP121 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Phenylephrine | Acros Organics | AC20724 | |
| Acetylcholine | Sigma | A6625 | |
| Pressure Myograph System | DMT |
References
- Bridges, L. E., Williams, C. L., Pointer, M. A., Awumey, E. M. Mesenteric artery contraction and relaxation studies using automated wire myography. J. Vis .Exp. (55), e3119 (2011).
- Arribas, S. M., Daly, C. J., McGrath, I. C. Measurements of vascular remodeling by confocal microscopy. Methods Enzymol. 307, 246-273 (1999).
- Lei, C., Yu, B., et al. Inhaled Nitric Oxide Attenuates the Adverse Effects of Transfusing Stored Syngeneic Erythrocytes in Mice with Endothelial Dysfunction after Hemorrhagic Shock. Anesthesiology. , (2012).
- Buys, E. S., Cauwels, A., et al. sGCα1β1 attenuates cardiac dysfunction and mortality in murine inflammatory shock models. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 297 (2), H654-H663 (2009).
- Buys, E. S., Sips, P., et al. Gender-specific hypertension and responsiveness to nitric oxide in sGCα1 knockout mice. Cardiovasc. Res. 79 (1), 179-186 (2008).
- Panza, J. A., Quyyumi, A. A., Brush, J. E., Epstein, S. E. Abnormal endothelium-dependent vascular relaxation in patients with essential hypertension. N. Engl. J. Med. 323 (1), 22-27 (1990).
- Huang, P. L., Huang, Z., et al. Hypertension in mice lacking the gene for endothelial nitric oxide synthase. Nature. 377 (6546), 239-242 (1995).
- Friebe, A., Koesling, D. The function of NO-sensitive guanylyl cyclase: what we can learn from genetic mouse models. Nitric Oxide. 21 (3-4), 149-156 (2009).
- Ehret, G. B., Munroe, P. B., et al. Genetic variants in novel pathways influence blood pressure and cardiovascular disease risk. Nature. 478 (7367), 103-109 (2011).
- Buys, E. S., Raher, M. J., et al. Genetic modifiers of hypertension in soluble guanylate cyclase alpha1-deficient mice. J. Clin. Invest. 122 (6), 2316-2325 (2012).
- Kauffenstein, G., Laher, I., Matrougui, K., Guerineau, N. C., Henrion, D. Emerging role of G protein-coupled receptors in microvascular myogenic tone. Cardiovascular Research. 95 (2), 223-232 (2012).
- Ruilope, L. M. Hypertension in 2010: Blood pressure and the kidney. Nat. Rev. Nephrol. 7 (2), 73-74 (2011).
- Michael, S. K., Surks, H. K., et al. High blood pressure arising from a defect in vascular function. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (18), 6702-6707 (2008).
- Mendelsohn, M. E. In hypertension, the kidney is not always the heart of the matter. J. Clin. Invest. 115 (4), 840-844 (2005).
