Imagem tridimensional de nociceptivos Fibras Nervosas intraepidérmicos em biópsias de pele humana

Resumo

A fim de estudar as alterações de fibras nervosas intra-epidérmica nociceptivos (IENFs) em neuropatias dolorosas (PN), protocolos que nós desenvolvemos pode examinar directamente as alterações morfológicas observadas tridimensionais em IENFs nociceptivos. Análise tridimensional de IENFs tem o potencial de avaliar as alterações morfológicas de IENF na PN.

Resumo

Uma biópsia da pele é geralmente utilizado para quantificar intraepidérmicos densidades de fibras nervosas (IENFD) para o diagnóstico de ^1,2 polineuropatia periférica. Actualmente, é prática comum para recolher três milímetros biópsias de pele a partir da perna distal (DL) e na coxa proximal (PT) para a avaliação de polineuropatias comprimento dependentes ^3. No entanto, devido à natureza de IENFs multidireccional, é um desafio para examinar sobreposição estruturas nervosas através da análise de imagem bidimensional (2D). Alternativamente, tridimensional de imagem (3D) poderia fornecer a melhor solução para este dilema.

No relatório atual, apresentamos métodos para aplicar imagens em 3D para estudar neuropatia dolorosa (PN). A fim de identificar IENFs, amostras de pele são processadas para análise de imunofluorescência de produto do gene da proteína 9.5 (PGP), um marcador neuronal panela. Actualmente, é uma prática padrão para diagnosticar neuropatias fibra pequenos usando IENFD determinada por imuno-histoquímica PGP usando microscopia de campo claro ^4. No presente estudo, aplicou-se análise de imunofluorescência dupla para identificar IENFD total, utilizando o PGP, e IENF nociceptiva, através da utilização de anticorpos que reconhecem a tropomiosina-receptor-quinase A (Trk A), o receptor de alta afinidade para o factor de crescimento do nervo ^5. As vantagens do IENF co-coloração com PGP e Trk anticorpos se beneficia do estudo de PN através da coloração claramente fibras PGP-positivas, nociceptivos. Estes sinais de fluorescência pode ser quantificada para determinar as alterações morfológicas e IENFD nociceptivos do IENF associados PN. As imagens fluorescentes são obtidas por microscopia confocal e processadas para análise 3D. 3D-imaging fornece capacidades de rotação para analisar mais alterações morfológicas associadas à PN. Tomados em conjunto, co-coloração fluorescente, imagem confocal e análise 3D beneficiar claramente o estudo de PN.

Introdução

Actualmente, é prática comum para os médicos para quantificar intraepidérmicos densidades de fibras nervosas (IENFD) a partir de biópsias de punção da pele, que podem ser utilizados para diagnosticar neuropatias pequenas fibras ^{3, 6-8.} As biópsias são tomadas a partir da perna distal (DL), de 10 cm acima do maléolo lateral, e a coxa proximal (PT), 20 cm abaixo da espinha ilíaca anterior ^9. Todos IENF são rotulados usando o produto do gene da proteína 9.5 (PGP), um marcador neuronal pan ^10-12. Actualmente, é uma prática padrão para diagnosticar neuropatias fibra pequenos usando IENFD determinada pela coloração PGP com brightfield micro....

Protocolo

Parte A: Imunohistoquímica

Preparação de placa de 96 poços e prevenção de fundo de coloração Dentre as biópsias da pele são recolhidos a partir de sujeitos humanos e incubados durante 12-24 h em solução de fixação (2% de paraformaldeído com uma solução de L-lisina 0,75 M (pH 7,4) e 0,05 mM de periodato de sódio) a 4 ° C como descrito anteriormente ^8. As amostras são então cryoprotected em tampão fosfato salino (PBS) com 20% de glicerol, a 4 ° C durante até 1 semana, incorporado nos meios de fixação da temperatura de corte óptima (OCT), e depois seccionado em secções de 50 um de espessura sobre um criostato. O protocolo abaixo desc....

Resultados

Foi aplicado o protocolo atual para estudar a morfologia do IENF na PT e DL biópsias de pele de pacientes com PN. A pele, a partir de três indivíduos, foi recolhido da Universidade de Utah, para demonstrar a Pathomorphology associado PN. Os temas incluem: Caso 1: um homem de 51 anos com uma história de PN de diabetes tipo 2 (duração: 14 meses; escore de dor: 51); Caso 2: um homem de 56 anos com uma história de PN de diabetes tipo 2 (duração: 108 meses; escore de dor: 47), e Caso 3: um homem de 66 anos de idade, com hist.......

Discussão

Medição da IENFD tem sido amplamente utilizada para determinar o grau de neuropatias periféricas ^13,14. Actualmente, o protocolo mais comumente utilizado apenas mede a densidade de fibras nervosas que penetram na membrana basal da epiderme, e não toma em consideração a ramificação axonal e / ou alterações morfológicas dos nervos. Além disso, a análise IENFD actual não foi mostrado para correlacionar IENFD com a presença de dor no PN ^15.

Nós relatamos anteriormente que o.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
10X PBS	Fisher Scientific	BP399-4	Para compor 1X PBS
Image-IT FX Signal	Invitrogen	I36933	Image-IT
Protein Gene Product 9.5 (coelho policlonal)	AbD Serotec	7863-0504	PGP
Tropomiosina Relacionada-Quinase A (cabra policlonal)	R & D Systems	AF1056	Trk A
Alexa Fluor 488 burro α-coelho	Invitrogen	A21206	AF488 burro α-cabra
Alexa Fluor 647 burro α-cabra	Invitrogen	A21447	AF647 burro α-cabra
Albumina, de soro bovino	Sigma-Aldrich	A7906-100	BSA
Triton X- 100	Sigma-Aldrich	T9284	TX-100
inoculação Loop	LeLoop	MP 199025	não calibrada
	Corning Incorporated	3603	Placa
de poço Prolong Gold antifade com DAPI	Invitrogen	P36931	DAPI
Vidro de cobertura de microscópio 22x22 mm	Fisher Scientific	12-541-B	Coverslips
Superfrost Plus Lâminas de microscópio	Fisher Lâminas de microscópio científicas	12-550-15	Microscópio
confocal de varredura a laser Olympus Fluoview Microscópio	confocal	Olympus	FV500
Temperatura ideal de corte	Sakura	4583	OCT
Criostato Leica		CM1850	Criostato

Placa de ensaio de 96 poços de