É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Imagem tridimensional de nociceptivos Fibras Nervosas intraepidérmicos em biópsias de pele humana

12.8K vistas

⸱

DOI:

10.3791/50331

⸱

29 de abril de 2013

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, University of Michigan , 2Department of Internal Medicine, University of Michigan

Neste artigo

Resumo

A fim de estudar as alterações de fibras nervosas intra-epidérmica nociceptivos (IENFs) em neuropatias dolorosas (PN), protocolos que nós desenvolvemos pode examinar directamente as alterações morfológicas observadas tridimensionais em IENFs nociceptivos. Análise tridimensional de IENFs tem o potencial de avaliar as alterações morfológicas de IENF na PN.

Resumo

Uma biópsia da pele é geralmente utilizado para quantificar intraepidérmicos densidades de fibras nervosas (IENFD) para o diagnóstico de 1,2 polineuropatia periférica. Actualmente, é prática comum para recolher três milímetros biópsias de pele a partir da perna distal (DL) e na coxa proximal (PT) para a avaliação de polineuropatias comprimento dependentes 3. No entanto, devido à natureza de IENFs multidireccional, é um desafio para examinar sobreposição estruturas nervosas através da análise de imagem bidimensional (2D). Alternativamente, tridimensional de imagem (3D) poderia fornecer a melhor solução para este dilema.

No relatório atual, apresentamos métodos para aplicar imagens em 3D para estudar neuropatia dolorosa (PN). A fim de identificar IENFs, amostras de pele são processadas para análise de imunofluorescência de produto do gene da proteína 9.5 (PGP), um marcador neuronal panela. Actualmente, é uma prática padrão para diagnosticar neuropatias fibra pequenos usando IENFD determinada por imuno-histoquímica PGP usando microscopia de campo claro 4. No presente estudo, aplicou-se análise de imunofluorescência dupla para identificar IENFD total, utilizando o PGP, e IENF nociceptiva, através da utilização de anticorpos que reconhecem a tropomiosina-receptor-quinase A (Trk A), o receptor de alta afinidade para o factor de crescimento do nervo 5. As vantagens do IENF co-coloração com PGP e Trk anticorpos se beneficia do estudo de PN através da coloração claramente fibras PGP-positivas, nociceptivos. Estes sinais de fluorescência pode ser quantificada para determinar as alterações morfológicas e IENFD nociceptivos do IENF associados PN. As imagens fluorescentes são obtidas por microscopia confocal e processadas para análise 3D. 3D-imaging fornece capacidades de rotação para analisar mais alterações morfológicas associadas à PN. Tomados em conjunto, co-coloração fluorescente, imagem confocal e análise 3D beneficiar claramente o estudo de PN.

Introdução

Actualmente, é prática comum para os médicos para quantificar intraepidérmicos densidades de fibras nervosas (IENFD) a partir de biópsias de punção da pele, que podem ser utilizados para diagnosticar neuropatias pequenas fibras 3, 6-8. As biópsias são tomadas a partir da perna distal (DL), de 10 cm acima do maléolo lateral, e a coxa proximal (PT), 20 cm abaixo da espinha ilíaca anterior 9. Todos IENF são rotulados usando o produto do gene da proteína 9.5 (PGP), um marcador neuronal pan 10-12. Actualmente, é uma prática padrão para diagnosticar neuropatias fibra pequenos usando IENFD determinada pela coloração PGP com brightfield microscopia 6. Além disso, vários grupos de pesquisa têm utilizaram protocolos de imunofluorescência para o PGP imunohistoquímica 7-9. Neuropatia fibra pequeno é comumente associado com dor neuropática. A fim de entender melhor o papel do IENF essencial para o processamento da dor, foi desenvolvida uma técnica para co-label IENF total, com fibras que geram dor. Nociceptiva IENF, especificamente Aδ e fibras C, pode ser estudada através da co-rotulagem de IENF com PGP e o marcador nociceptiva, tropomyosin-receptor-quinase A (Trk A) 5. Trk A é o receptor de elevada afinidade para o factor de crescimento do nervo, que é essencial para o desenvolvimento de nocicepção. As fibras nervosas nociceptivas A positivas Trk são fibras peptidérgicas que expressam a substância P (SP) e peptídeo relacionado com gene da calcitonina (CGRP). Anteriormente, Lauria e colegas aplicaram a técnica de dupla marcação para estudar PN, co-rotulagem IENF PGP positivo com um marcador nociceptivo 10. No nosso estudo anterior, foi demonstrado que IENF Trk A-positivos, mas não IENF Trk A-negativos, foram regulada positivamente num modelo animal de neuropatia diabética dolorosa 5. Esta técnica de co-rotulagem fornece a capacidade de comparar a quantificação de IENFD nociceptiva totalizar IENFD ea capacidade de estudar alterações morfológicas associadas à PN. A capacidade de visualizar nociceptiva IENF e compare quantificação de IENFD total IENFD nociceptiva poderia fornecer provas objectivas para a presença da dor, e possivelmente percepção da intensidade da dor associada com PN. Esta técnica é também aplicável para a pele de modelos animais. Em comparação com estudos anteriores, o protocolo actual descreve métodos para análise de imagem 3D, criando a possibilidade de evitar os erros que possam ocorrer na análise da imagem 2D.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

Parte A: Imunohistoquímica

Preparação de placa de 96 poços e prevenção de fundo de coloração Dentre as biópsias da pele são recolhidos a partir de sujeitos humanos e incubados durante 12-24 h em solução de fixação (2% de paraformaldeído com uma solução de L-lisina 0,75 M (pH 7,4) e 0,05 mM de periodato de sódio) a 4 ° C como descrito anteriormente 8. As amostras são então cryoprotected em tampão fosfato salino (PBS) com 20% de glicerol, a 4 ° C durante até 1 semana, incorporado nos meios de fixação da temperatura de corte óptima (OCT), e depois seccionado em secções de 50 um de espessura sobre um criostato. O protocolo abaixo descrito é concebido para oito cortes de pele, o número máximo possível de secções de pele de sofrer imunohistoquímica de flutuação livre em uma placa de 96 poços.

DIA 1:

1. Prevenção da imunoreactividade não específica no estrato córneo

  1. Etiqueta de placa de 96 poços, como mostrado na Figura 1.
  2. Adicionar 150 ul de Imagem-IT FX sinal (Imagem-IT), eficaz para o bloqueio de fundo de coloração 11,12, para cada poço na linha 1 da placa de 96 poços.
  3. Adicionar 150 ul de PBS 1X para cada poço na fila 2 e 3 da placa de 96 poços.
  4. Adquirir duas seções 50 mM por paciente: uma seção da biópsia tomado em DL, uma seção da biópsia tomada na PT. Uma ansa de inoculação (LeLoop) é usado para transferir a partir de secções de uma lavagem para a seguinte para evitar danos morfológica. Gentilmente transferir cada seção 50 mM, utilizando um loop inoculação, em um indivíduo bem de Linha 1, que contém a imagem-IT. Incubar seções em Imagem-lo por 30 minutos em temperatura ambiente em uma cadeira de balanço plana.
  5. Lavar duas vezes com secções 1X PBS (linhas 2 e 3) durante 10 min à TA. Coloque em um prato bem roqueiro plana entre lavagens.

2. Preparação de BSA a 5% da solução de bloqueio e 1% de solução de lavagem

  1. Enquanto as seções de biópsia estão incubando em Imagem-IT, prepare-se 5% de bloqueio soluçãoção (BSA, TX-100, 0,3% de solução 0,1 M de PBS-BSA a vórtice até que se dissolva completamente 5%).
  2. Adicionar 150 ul de solução de bloqueio BSA a 5% em cada cavidade de linha 4.
  3. Utilizando uma ansa de inoculação, transferir secções em poços individuais de 5% de solução de bloqueio de BSA. Incubar as secções em solução de bloqueio de BSA 5% durante 1-2 horas à temperatura ambiente em um balancim plana.

3. Preparação de 1% de BSA e da solução de lavagem a diluição dos anticorpos primários

  1. Embora as secções são incubar em 5% de solução de bloqueio de BSA, preparar uma solução de lavagem 1% (BSA a 1%, 0,3% de TX-100, solução de PBS-Vortex 0,1 M até que se dissolva completamente BSA).
  2. Embora as secções são incubar em 5% de solução de bloqueio de BSA, dilui-se os anticorpos primários em 1% de solução de lavagem.
    1. Durante oito secções (8 x 150 mL = 1,200 mL) é necessário um total de 1200 ul. Os anticorpos primários são feitos em 1500 ul (cerca de 20% volume extra).
    2. As diluições dos anticorpos primários: PGP, 1:500; Trk A,1:500 em BSA a 1% solução de lavagem.

4. Incubação de biópsias seccionados em Anticorpo primário

  1. Adicionar 150 ul de anticorpos primários diluídos nas cavidades designadas da placa de 96 poços (linha 5).
  2. Transferir secções de 5% de solução de bloqueio (linha 4) para os poços de anticorpos primários designados (Linha 5).
  3. Selar a placa de 96 poços com parafilme e uma folha de alumínio para evitar a secagem e exposição à luz.
  4. Incubar a placa de 96 poços de O / N a 4 ° C em um balancim plana.

DIA 2:

5. Enxaguar biópsias em BSA a 1% solução de lavagem

  1. Adicionar 150 ul de solução de lavagem 1% de BSA para cada poço na linha 6, 7 e 8.
  2. Enxaguar secções três vezes com solução de lavagem 1% de BSA (linhas 6, 7 e 8), durante 1 hora de cada vez, à TA. Cobrir a placa bem com papel alumínio e coloque no balancim plana entre lavagens.

6. A diluição dos anticorpos secundários

  1. Embora as secções são incubadas no último enxaguamento de solução de lavagem 1% de BSA (linha 8), dilui-se em solução de anticorpos secundários de lavagem 1% de BSA:
    1. Durante oito secções (8 x 150 mL = 1,200 mL) é necessário um total de 1200 ul. Os anticorpos secundários são feitos em 1500 ul (cerca de 20% volume extra).
    2. Diluições dos anticorpos secundários: para PGP (Alexa Fluor 488 burro anti-coelho, 1:250), para Trk A (Alexa Fluor 647 burro anti-cabra, 1:250) em solução de lavagem 1% BSA.

7. Incubação de biópsias seccionados em Anticorpo secundário

  1. Adicionar 150 uL de anticorpos secundários diluídos nas suas cavidades designadas da placa de 96 poços (linha 9).
  2. Transferir secções de solução a 1% de BSA de bloqueio (Linha 8) no poço de anticorpo secundário (linha 9).
  3. Selar a placa de 96 poços com parafilme e uma folha de alumínio para evitar a secagem e exposição à luz.
  4. Incubar seções no designado secundário anticorpos O/ N a 4 ° C em um balancim plana.

8. Enxaguar biópsias em BSA a 1% solução de lavagem

  1. Adicionar 150 ul de solução de lavagem 1% de BSA para cada poço na linha 10, 11 e 12.
  2. Enxaguar secções três vezes com solução de lavagem 1% de BSA (linhas 10, 11 e 12) durante 1 hora de cada vez, à TA. Cobrir a placa bem com papel alumínio e coloque em uma cadeira de balanço plana entre lavagens.

9. Preparação de Lâminas de Microscopia e montagem Biopsias Seccionado

  1. Enquanto secções de biópsia estão incubando no último enxaguamento de solução de lavagem 1% de BSA (linha 12), preparam lâminas de microscópio.
  2. Coloque 50 ml de solução a 1% de lavagem BSA em um slide de cada vez.
  3. Remover secções de 1% de solução de lavagem de BSA (linha 12), e colocá-lo na gota 50 mL de solução de lavagem 1% de BSA na lâmina de microscópio designado. Após optimização da posição da secção, remover o excesso de solução de lavagem 1% de BSA com uma pipeta de vidro bulbed, tomando precauçõesevitar tocar o espécime.

NOTA: Certifique-secção não é dobrado, a amostra deve ser plana contra a superfície da lâmina de microscópio.

  1. Coloque uma gota de reagente Prolongar montagem com DAPI perto da biópsia na lâmina de microscópio antifade Ouro. Dê uma lamela de vidro mm microscópio 22x22 e colocá-lo suavemente sobre a biópsia e uma gota de reagente Prolongar antifade ouro com DAPI queda. Repita a operação para cada seção.
  2. Vamos lâminas de microscópio seca O / N em RT na escuridão.

NOTA: Remova as bolhas de ar usando uma ponteira. Limpe o excesso de prolongar reagente antifade Ouro.

Parte B: imagem confocal

10. Confocal

  1. Sinais de fluorescência de imagem usando uma Olympus FluoView 500 microscópio confocal de varredura a laser com óleo de imersão (1,3 NA) objetiva de 40X e zoom duas vezes com software versão 5.0 FluoView.
  2. Use Alexa Fluor 488 e Alexa Fluor 647 para excitar a 543 nm HeNe laser verde e 633 nm HeNe laser vermelho, respectivamente. O sinal Alexa Fluor 488 é representado por um olhar verde a tabela (LUT) e Alexa Fluor 647 por uma LUT vermelho.
  3. Definir as aberturas confocais para cada detector a 400 um para melhorar os sinais. Varreduras seqüenciais devem ser tomados com uma resolução de 1024 x 1024 para maximizar a separação do sinal.
  4. Capturar tridimensional z séries utilizando 1,2 mM intervalos z-passo (com base na unidade de digitalização óptima calculados pelo software FluoView) com média de Kalman (dois quadros).

Parte C: visualização tridimensional e animação

11. Tridimensional (3D) Visualização e Animação

  1. Abrir arquivos FluoView em software x64 Imaris (versão 7.3, Bitplane AG) para visualizar os conjuntos de imagens 3D.
  2. Ajustar o indicador conforme necessário para aumentar o contraste do sinal específico do nervo.
  3. Criar um surface para visualizar o limite dermo-epidérmica. Use a ferramenta Contorno no modo de desenho para desenhar o contorno.
  4. Atribuir uma superfície semi-transparente para o limite, a fim de ver os sinais fluorescentes subjacentes.
  5. Capturar imagens estáticas dos sinais fluorescentes em 3D para criar imagens instantâneo do filme em 3D.
  6. Use o recurso de animação para criar um filme em 3D. As imagens podem ser giradas em 360 graus várias vezes para mostrar cada sinal separadamente e intercalado (Figuras 2, 3 e 4). Definir animação para criar filmes que consistem em 200 quadros animaram a 15 quadros por segundo. Salve cada filme como um arquivo AVI cru.
  7. Comprimir o final do filme AVI com o software VirtualDub (versão 1.9.4).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Foi aplicado o protocolo atual para estudar a morfologia do IENF na PT e DL biópsias de pele de pacientes com PN. A pele, a partir de três indivíduos, foi recolhido da Universidade de Utah, para demonstrar a Pathomorphology associado PN. Os temas incluem: Caso 1: um homem de 51 anos com uma história de PN de diabetes tipo 2 (duração: 14 meses; escore de dor: 51); Caso 2: um homem de 56 anos com uma história de PN de diabetes tipo 2 (duração: 108 meses; escore de dor: 47), e Caso 3: um homem de 66 anos de idade, com hist...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Medição da IENFD tem sido amplamente utilizada para determinar o grau de neuropatias periféricas 13,14. Actualmente, o protocolo mais comumente utilizado apenas mede a densidade de fibras nervosas que penetram na membrana basal da epiderme, e não toma em consideração a ramificação axonal e / ou alterações morfológicas dos nervos. Além disso, a análise IENFD actual não foi mostrado para correlacionar IENFD com a presença de dor no PN 15.

Nós relatamos anteriormente que o...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Não há conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Grants Saúde K08 NS061039-01A2, o Programa de Neurologia Research & Discovery e The Taubman Alfred A. Instituto de Pesquisa de Medicina da Universidade de Michigan. Este trabalho utilizou a Morfologia e Análise de Imagem Núcleo de Michigan Diabetes Centro de Pesquisa e Formação, financiado pelo National Institutes of Health Grant 5P90 DK-20572 do Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais. Os autores gostariam de agradecer a Robinson Singleton e Gordon Smith (University of Utah) pela sua generosa doação de amostras de pele humana para apoiar o desenvolvimento inicial da técnica de imuno-histoquímica biomarcador nociceptiva.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
10X PBSFisher ScientificBP399-4Para compor 1X PBS
Image-IT FX SignalInvitrogenI36933Image-IT
Protein Gene Product 9.5 (coelho policlonal)AbD Serotec7863-0504PGP
Tropomiosina Relacionada-Quinase A (cabra policlonal)R & D SystemsAF1056Trk A
Alexa Fluor 488 burro α-coelhoInvitrogenA21206AF488 burro α-cabra
Alexa Fluor 647 burro α-cabraInvitrogenA21447AF647 burro α-cabra
Albumina, de soro bovinoSigma-AldrichA7906-100BSA
Triton X- 100Sigma-AldrichT9284TX-100
inoculação LoopLeLoopMP 199025não calibrada
Corning Incorporated3603Placa
de poço Prolong Gold antifade com DAPIInvitrogenP36931DAPI
Vidro de cobertura de microscópio 22x22 mmFisher Scientific12-541-BCoverslips
Superfrost Plus Lâminas de microscópioFisher Lâminas de microscópio científicas12-550-15Microscópio
confocal de varredura a laser Olympus Fluoview MicroscópioconfocalOlympusFV500
Temperatura ideal de corteSakura4583OCT
Criostato LeicaCM1850Criostato
Placa de ensaio de 96 poços de

Referências

  1. Lauria, G., Holland, N., et al. Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy. J. Neurol. Sci. 164 (2), 172-178 (1999).
  2. Sullivan, K. A., Hayes, J. M., et al. Mouse models of diabetic neuropathy. Neurobiol. Dis. 28 (3), 276-285 (2007).
  3. McArthur, J. C., Stocks, E. A., Hauer, P., Cornblath, D. R., Griffin, J. W. Epidermal nerve fiber density: normative reference range and diagnostic efficiency. Arch. Neurol. 55 (12), 1513-1520 (1998).
  4. Griffin, J. W., McArthur, J. C., Polydefkis, M. Assessment of cutaneous innervation by skin biopsies. Curr. Opin. Neurol. 14 (5), 655-659 (2001).
  5. Cheng, H. T., Dauch, J. R., Hayes, J. M., Yanik, B. M., Feldman, E. L. Nerve growth factor/p38 signaling increases intraepidermal nerve fiber densities in painful neuropathy of type 2 diabetes. Neurobiol. Dis. 45 (1), 280-287 (2012).
  6. Lauria, G., Lombardi, R., Camozzi, F., Devigili, G. Skin biopsy for the diagnosis of peripheral neuropathy. Histopathology. 54 (3), 273-285 (2009).
  7. Vlckova-Moravcova, E., Bednarik, J., Dusek, L., Toyka, K. V., Sommer, C. Diagnostic validity of epidermal nerve fiber densities in painful sensory neuropathies. Muscle Nerve. 37 (1), 50-60 (2008).
  8. Casanova-Molla, J., Morales, M., et al. Axonal fluorescence quantitation provides a new approach to assess cutaneous innervation. J. Neurosci. Methods. 200 (2), 190-198 (2011).
  9. Wang, L., Hilliges, M., Jernberg, T., Wiegleb-Edstrom, D., Johansson, O. Protein gene product 9.5-immunoreactive nerve fibres and cells in human skin. Cell Tissue Res. 261 (1), 25-33 (1990).
  10. Lauria, G., Morbin, M., et al. Expression of capsaicin receptor immunoreactivity in human peripheral nervous system and in painful neuropathies. J. Peripher. Nerv. Syst. 11 (3), 262-271 (2006).
  11. Penna, G., Fibbi, B., et al. Human benign prostatic hyperplasia stromal cells as inducers and targets of chronic immuno-mediated inflammation. J. Immunol. 182 (7), 4056-4064 (2009).
  12. Lentz, S. I., Edwards, J. L., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro. J. Histochem. Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).
  13. Polydefkis, M., Hauer, P., Griffin, J. W., McArthur, J. C. Skin biopsy as a tool to assess distal small fiber innervation in diabetic neuropathy. Diabetes Technol. Ther. 3 (1), 23-28 (2001).
  14. Lauria, G. Small fibre neuropathies. Curr. Opin. Neurol. 18 (5), 591-597 (2005).
  15. Sorensen, L., Molyneaux, L., Yue, D. K. The relationship among pain, sensory loss, and small nerve fibers in diabetes. Diabetes Care. 29 (4), 883-887 (2006).
  16. Lauria, G., Morbin, M., et al. Axonal swellings predict the degeneration of epidermal nerve fibers in painful neuropathies. Neurology. 61 (5), 631-636 (2003).
  17. Herrmann, D. N., McDermott, M. P., et al. Epidermal nerve fiber density, axonal swellings and QST as predictors of HIV distal sensory neuropathy. Muscle Nerve. 29 (3), 420-427 (2004).
  18. Navarro, X. Chapter 27: Neural plasticity after nerve injury and regeneration. Int. Rev. Neurobiol. 87, 483-505 (2009).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Microscopia ConfocalAn lise ImunofluorescenteProduto G nico da Prote na 9 5Receptor de Tropomiosina Quinase ABiomarcador NociceptivoSec es de Bi psia Cut neaAltera es Morfol gicasNeuropatia Dolorosa
Imagem tridimensional de nociceptivos Fibras Nervosas intraepidérmicos em biópsias de pele humana
Entre em contato
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.