As propriedades paramagnéticas de hemozoin são utilizados para isolar as fases tardias da Plasmodium falciparum-Infectadas células vermelhas do sangue que crescem em cultura. O método é simples e rápido e não afeta as capacidades subseqüentes invasoras dos parasitas.
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Neste artigo
Resumo
Resumo
Ao contrário de outras espécies de Plasmodium, P. falciparum pode ser cultivado no laboratório, o que facilita o seu estudo 1. Enquanto a parasitemia obtida pode atingir o limite ≈ 40%, o investigador geralmente mantém a percentagem de cerca de 10%. Em muitos casos, é necessário isolar o parasita contendo glóbulos vermelhos (RBC) de os não infectados, para enriquecer a cultura e proceder com uma dada experiência.
Quando P. falciparum infecta o eritrócito, o parasita se degrada e se alimenta de hemoglobina 2, 3. No entanto, o parasita tem de lidar com uma porção heme muito tóxico contendo ferro 4, 5. O parasita escapa a sua toxicidade mediante a transformação do heme em um polímero de cristal inerte chamado haemozoin 6, 7. Esta molécula contendo ferro é armazenado no seu vacúolo alimentar e o metal em que tem um estado de oxidação diferente daquele do heme 8. O estado férrico em ferro no hemeozoin confere-lhe uma propriedade paramagnética ausente em eritrócitos não infectados. À medida que o parasita invasor atinge a maturidade, o conteúdo de haemozoin também aumenta 9, que confere paramagnetismo ainda mais sobre as últimas fases de P. falciparum no interior de eritrócitos.
Com base nesta propriedade paramagnético, os últimos estágios de P. As células infectadas falciparum-vermelhos do sangue podem ser separados pela passagem da cultura através de uma coluna contendo as esferas magnéticas. Estes grânulos tornar magnético quando as colunas que contêm eles são colocados sobre um suporte de íman. RBC infectados, devido à sua paramagnetismo, será então aprisionado no interior da coluna, enquanto que o fluxo através conterá, na sua maior parte, os eritrócitos não infectados e os estágios iniciais da contendo o parasita.
Aqui, descrevemos a metodologia para enriquecer a população de parasitas estágio final com colunas magnéticas, que mantém a viabilidade do parasita bom 10.Depois de executar este processo, a cultura não acoplada pode ser retornado para uma incubadora para permitir que as restantes parasitas que continue a crescer.
Protocolo
Todos os passos do protocolo, excepto para centrifugações, deve ser realizada dentro de uma capa para manter a amostra estéril.
1. Isolamento fase tardia de P. falciparum eritrócitos infectados
Todos os estágios de Plasmodium eritrócitos infectados podem ser separados com esta metodologia, uma vez que hemozoin, que confere o paramagnetismo em que o parasita é um metabolito comum para o género. A parasitemia elevada (3-10%) em cultura é recomendado para obter melhores rendimentos com o presente protocolo, apesar de uma cultura típica irá conter 2-4% de hematócrito (percentagem de volume de células vermel....
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Resultados
Na Figura 2, a cultura que passa através da coluna magnético é mostrado, antes (A) e após (B). Uma a duas eritrócitos infectados são geralmente vistos em um campo de ampliação de 100X, como mostrado na Figura 2, com as setas que apontam para eritrócitos infectados na Figura 2A. Num procedimento típico, a partir de uma cultura em 5% de parasitemia (Figura 2A), o desempenho deste procedimento normalmente produz eritrócito.......
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Discussão
As culturas in vitro de parasita da malária P. falciparum exibem uma parasitemia limitada, com mais de metade das células vermelhas do sangue não infectados, no ponto mais elevado de proliferação de cultura. Para a maioria das experiências de investigação, é desejável para funcionar apenas com os eritrócitos infectados. Para este fim, uma técnica de separação é necessário dividir a cultura de acordo com a infecção. Métodos úteis incluem a utilização de estreptolisina para permeabilizar e lisar.......
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Divulgações
Não temos nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado por subvenções PRB-009 para o CS e uma bolsa de doutorado à LC, do Nacional Secretaría de Ciencia y Tecnología (SENACYT), Panamá.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | Comentários (opcional) |
| RPMI 1640 Modificado Hepes | Sigma-Aldrich | R4130 | Suplementado com 10% de soro humano, 2% de glucose, bicarbonato de sódio e 0,2% |
| Separador MidiMACS | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Colunas LS | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Hemocitômetro | Grafco | Grafco Neubauer Câmara | Pode ser encontrado através de muitos outros fornecedores |
Referências
- Jensen, J. B., Trager, W. Plasmodium falciparum in culture: use of outdated erythrocytes and description of the candle jar method. J. Parasitology. 63 (5), 883-886 (1977).
- Guzman, I. Y., Francis, S. E., Oksman, A., Smith, C. E., Duffin, K. L., Goldberg, D. E.
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Reimpressões e permissões
