Medindo intracelular de Ca 2 + Mudanças no esperma humano, utilizando quatro técnicas: fluorometria convencional, Parado Fluorometria fluxo, citometria de fluxo e única célula de imagem

Summary

Intracelular de Ca ^{2 +} Dinâmica são muito importantes na fisiologia do esperma e Ca ^{2 +} Sensíveis corantes fluorescentes constituem uma ferramenta versátil para estudá-los. Experiências da população (fluorometria e parou fluorometria fluxo) e experimentos com células individuais (citometria de fluxo e de imagem única célula) são usados ​​para rastrear espaço-temporal [Ca ^{2 +}] Alterações nas células de espermatozóides humanos.

Abstract

Os espermatozóides são células reprodutoras masculinas, especialmente concebidos para alcançar, reconhecer e fundir-se com o ovo. Para executar essas tarefas, os espermatozóides precisam estar preparados para enfrentar um ambiente em constante mudança e superar várias barreiras físicas. Sendo na sua essência transcriptionally e translação em silêncio, estas células móveis dependem profundamente sobre diversos mecanismos de sinalização para orientar-se e nadar de forma dirigida, e de lidar com difíceis condições ambientais durante a sua jornada para encontrar o óvulo. Em particular, o Ca ^{2 +} sinalização mediada é essencial para várias funções do esperma: activação de motilidade, capacitação (um processo complexo, que se prepara de esperma para a reacção do acrossoma), e a reacção do acrossoma (um evento exocitótica que permite a fusão espermatozóide-ovo). A utilização de corantes fluorescentes para controlar flutuações intracelulares deste ião é de extraordinária importância, devido à sua facilidade de aplicação, a sensibilidade, e versatilidade de detexão. Usando um único protocolo corante de carregamento de nós utilizamos quatro técnicas fluorométricos diferentes para monitorar esperma Ca ^{2 +} dinâmica. Cada técnica fornece informações distintas que permite a resolução espacial e / ou temporal, gerando dados, tanto a nível da população de células de uma única célula e.

Introduction

^{Ca2 +} é um segundo mensageiro universal das vias de transdução de sinal em células eucarióticas. Intracelular de ^{Ca2 + (Ca2 +} _i) participa na regulação de vários processos fisiológicos fundamentais tanto em células excitáveis ​​e não excitáveis. A importância e da universalidade da ^{Ca2 +} como segundo mensageiro durante eventos de transdução de sinal é obtido a partir da sua versatilidade espácio-temporal, na transmissão de informação no interior da célula. Enquanto ^{Ca2 +} não podem ser sintetizados de novo ou degradada no interior da célula, a sua concentração intracelular ([Ca ^{2 +]} _i)

Protocol

Neste artigo relatamos o uso das quatro técnicas acima mencionadas para medir [Ca ^{2 +]} _i alterações nas células de esperma humano. Utilizou-progesterona para desencadear uma resposta de Ca ^{2 +,} como é bem estabelecido que este esteróide produz um transiente [Ca ^{2 +]} _i aumentar em espermatozóides. Particularmente, no esperma humano, progesterona ativa diretamente a um canal de ^{Ca2 +} (isto é CatSper) exclusivamente expressa na membrana plasmática das células de esperma ^10,11. Nós também medido em repouso [Ca ^{2 +]} _i antes e depois de capacitação dado que também é amplament....

Results

Figura 1. Diagrama esquemático do protocolo experimental para a preparação de amostras de espermatozóides pelo método aquático. Os principais passos para a separação de espermatozóides móveis e para ajustamento da sua concentração são ilustrados. O último passo de incubação é realizado apenas quando a capacitação é necessár.......

Discussion

Sinalização intracelular é vital para a maioria das atividades celulares; ^{Ca2 +} é um mensageiro ubíquo que acompanha células de mamífero ao longo de toda a sua vida útil, a partir da sua origem no momento da fertilização, ao fim do seu ciclo de vida. Em resposta a diferentes estímulos, [Ca ^{2 +]} i aumenta, oscila e diminui com a codificação espaço-temporal e, consequentemente, diversos processos são ativados, modulados ou denunciado por Ca ^{2 +} mensagens codificadas. Ca ^{2 +} intr.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ham's F-10	Sigma-Aldrich	N-6013
Albumina de soro bovino	Sigma-Aldrich	A-7906
Cloreto de cálcio di-hidratado aprox. 99%	Sigma-Aldrich	C-3881
Câmara de contagem Makler	SEFI Medical Insruments LTD	SEF-MAKL
Fluo-3 AM	Invitrogen	F-1242	20 frascos/50 μ g cada
Ionomicina	Alomone	I-700
Progesterona	Sigma-Aldrich	P0130
Cloreto de sódio	Sigma-Aldrich	S-9888	Reagentes para meio de esperma humano (HSM)
Cloreto de potássio	Sigma-Aldrich	P-3911	Reagentes para meio de esperma humano (HSM)
Bicarbonato de sódio	JT Baker	3506	Reagentes para meio de esperma humano (HSM)
Cloreto	de magnésio Sigma-Aldrich	M-2670	Reagentes para meio de esperma humano (HSM)
Cloreto de cálcio anidro	Sigma-Aldrich	C-1016	Reagentes para meio de esperma humano (HSM)
HEPES	Sigma-Aldrich	H-3125	Reagentes para meio de esperma humano (HSM)
D-Glucose	JT Baker	1906-01	Reagentes para esperma humano meio (HSM)
Piruvato de sódio	Sigma-Aldrich	P-2256	Reagentes para meio de esperma humano (HSM)
L-lactato de sódio (aprox. 99%)	Sigma-Aldrich	L-7022	Reagentes para meio de esperma humano (HSM)
Iodeto de propídio	Invitrogen	L-7011	Componente B
Triton X-100 (t-octilfenoxipolietoxietanol)	Sigma-Aldrich	X-100	Solução de 2,4 mM em água
lamínula redonda	VWR	48380 080
poli-L-lisina	Sigma-Aldrich	P8920
Cloreto de manganês	Sigma-Aldrich	M-3634
Attofluor; Câmara celular, para microscopia	Life technologies	A-7816
Sulfóxido de dimetila	Sigma-Aldrich	D2650	5x5 ml