Isolamento, processamento e análise de células gengivais murino

Resumo

Este estudo descreve uma técnica eficiente para isolar e processar tecido gengival da cavidade oral do rato de modo a produzir uma cultura de uma única célula. As células resultantes podem ser ainda utilizado para a análise de citometria de fluxo e os estudos moleculares.

Resumo

Desenvolvemos uma técnica para isolar e processar o tecido gengival murino por citometria de fluxo, os estudos moleculares e com precisão. A gengiva é um tecido único e importante para estudar os mecanismos imunitários, porque está envolvido na resposta imune do hospedeiro contra o biofilme oral, que podem provocar doenças periodontais. Além disso, a proximidade da gengiva para o tecido do osso alveolar também permite estudar a remodelação óssea em condições inflamatórias. Nosso método produz grande quantidade de células do sistema imunológico que permite a análise de até populações raras células, tais como células de Langerhans e células T reguladoras como demonstramos anteriormente ^1. Empregando ratinhos para estudar as respostas imunitárias locais envolvidos na perda de osso alveolar durante as doenças periodontais, é vantajoso, devido à disponibilidade de várias ferramentas imunológicas e experimental. No entanto, devido ao seu pequeno tamanho e ao acesso relativamente inconveniente para a gengiva murino, muitos estudos evitada exame de this tecidos críticos. O método descrito neste trabalho podem facilitar a análise de gengiva, que poderá aumentar a atenuante no sistema imunitário por via oral e o seu papel durante as doenças periodontais.

Introdução

Gengiva é o tecido macio em torno da porção cervical dos dentes e cobre o processo alveolar (Figura 1). A gengiva é um tipo de mucosa mastigatória que podem ser ainda separadas no epitélio da mucosa e do tecido conjuntivo (também conhecido como submucosa ou lâmina). A estrutura anatômica da gengiva e dentes adjacentes permite que as bactérias para residir e desenvolver placa (biofilme) que desafia constantemente o sistema imunológico local. Como resultado, a resposta inflamatória desenvolve na gengiva, o que, em determinadas circunstâncias torna-se destrutiva - uma situação designada por doenças periodontais ^2. Basicamente, patologias periodontais placa induzidos podem ser divididos em gengivite e periodontite. Gengivite representa uma condição reversível da resposta inflamatória local que está confinada ao gengiva. A periodontite, por outro lado, é um processo de destruição irreversível em que o aparelho de fixação (osso alveolar, periodontalligamento, cemento e gengiva) é destruído ^3.

A gengiva foi proposto para servir tanto locais como efectoras e indutivo durante ^quatro doenças periodontais. Estudos em humanos têm sugerido que, em resposta a placa dental, células efetoras imunes e as moléculas se infiltrado ou partida da gengiva ^5-7 dinamicamente. Esta actividade foi demonstrado desempenhar um papel importante na destruição periodontal ^8,9. Considerando que os dados gerados por esses estudos forneceram informações valiosas sobre esse processo patológico, trabalhando com os tecidos humanos possuem grandes limitações éticas, técnicas e experimental. O desenvolvimento de modelos experimentais permitiram experimentações de causa-efeito via empregando camundongos transgênicos e intervenções vivo ^10. Como resultado, o nosso conhecimento sobre os mecanismos envolvidos na doença periodontal aumentaram consideravelmente durante as últimas duas décadas. Ainda assim, devido à complexidade da doença periodontal, não existeum debate em curso sobre a natureza da resposta imune local facilitando a destruição dos tecidos. Há também uma falta de compreensão sobre a função das células imunitárias centrais na gengiva durante as doenças periodontais. É, portanto, essencial para estudar eventos inflamatórios patológicos que ocorrem no tecido alvo da doença da gengiva.

Protocolo

Prepare-se com antecedência:

• PBS + FCS a 2%
• PBS + FCS a 2% com 2 mg / ml de colagenase de tipo II e de 1 mg / ml de ADNase tipo I (1 ml para cada amostra)
• Instrumentos cirúrgicos esterilizados
• Solução de EDTA 0,5 M

1. Superior Técnica Excisão Gengival

1. Eutanásia ratos usando orientação IACUC aprovado.
2. Corte ambos os lados da cavidade oral, incluindo as bochechas e do ramo da mandíbula com uma acentuada / blunt tesoura reta.
3. Puxe para baixo a mandíbula.
4. Cortar os tecidos moles e duros por uma linha imaginária que 1 milímetro atrás dos molares terços padrão com uma tesoura. Dirigir a tesoura perpendiculares ao plano do osso palatino (Figura 2A, linha azul).
5. Inciso os tecidos duros e moles 2 milímetros por trás dos incisivos (Figura 2A, linha azul).
6. Puxe para baixo a parte anterior da boca. A cavidade nasal é observável após esta etapa.
7. Coloque a tesouraparalelo ao paladar, colocar uma lâmina para dentro da cavidade nasal, a outra lâmina deve incisão no vestíbulo. Corte até a incisão posterior (Figura 2A, as linhas verdes). Repetir esta etapa em ambos os lados do maxilar. No final da maxila é separada do resto do crânio (Figura 2B).
8. Retire a maxila, cortá-lo no meio de sutura (Figura 2, linha tracejada preta) e cortar o tecido palatal de cada hemi-maxila até atingir o osso alveolar.
9. Descasque os tecidos gengivais (ambos hemi-maxilas) a partir de sua borda anterior com Adson fórceps (sem dentes).
10. Coloque a gengiva excisada numa placa com PBS + 2% de FCS.

2. Gengival Processamento

1. Coloque a gengiva excisadas num prato de cultura de tecido (35 x 10 mm) com 1 ml de PBS + FCS a 2%, 2 mg / mL de colagenase tipo II e 1 mg / ml de ADNase tipo I.
2. Picar bem o tecido com um N ° 15 lâmina cirúrgica estéril.
3. Transfer o tecido da placa para um tubo de ensaio de 15 mL cónico.
4. Lave as células de tecido / remanescentes na placa com 1 ml de PBS + FCS a 2% e de transferência para o mesmo tubo de ensaio.
5. Incubar numa incubadora num agitador durante 20 min a 37 ° C, 200 rpm (recomendação: pré-aquecimento da incubadora).
6. Adicionar 20 ul de EDTA 0,5 M e incubar durante mais 10 min a 37 ° C, 200 rpm.
7. Encher o tubo de ensaio até 12 ml com PBS + FCS a 2% e centrifugação a 4 ° C, a 400 xg, durante 8 min (recomendação: pré-frio a centrífuga).
8. Remover o sobrenadante e ressuspender as células com 2 ml de PBS + FCS a 2%.
9. Filtrar a amostra com 70 mM de células-filtro e salvar fluir.
10. Centrifugar a 4 ° C, 320 xg durante 5 min.
11. Remover as células sobrenadante e ressuspender com 300 mL PBS + 2% FCS.
12. Contar as células ⁽⁵ x 10 células de aproximadamente 5-10 são esperados a partir de uma única maxila).

3. Anticorpo extracelular e intracelularColoração por citometria de fluxo

Recomenda-se a trabalhar dentro de uma capa, com as luzes apagadas. É crítico para manter as células em ambiente frio constante, bem como todos os materiais necessários.

1. Stain células contra moléculas extracelulares adicionando 0,2-0,5 ug de cada anticorpo seleccionado por 1 x 10 ⁶ células, num volume total de 100 ul.
2. Vortex brevemente.
3. Incubar os tubos durante 15 min no escuro a 4 ° C.
4. Lavar as células com 2 ml de PBS + FCS a 2%.
5. Centrifugar a 4 ° C, 320 xg durante 5 min.
6. Aspirar células sobrenadante e ressuspender adicionando, gota a gota, 500 mL frio BD Cytoperm / Cytofix enquanto vortex.
7. Incubar os tubos durante 40 minutos a 4 ° C no escuro.
8. Vortex brevemente.
9. Lave as células duas vezes com 1 ml de frio BD Perm / Wash tampão e centrifugação a 800 xg durante 7 minutos a 4 ° C.
10. Aspirar o sobrenadante exceto para 300 ml.
11. Mancha células intracelular poradição de 1 ug de cada anticorpo seleccionado por 1 x 10 ⁶ células, num volume total de 100 ul.
12. Vortex brevemente.
13. Incubar durante 30 min no escuro a 4 ° C.
14. Lave as células duas vezes com 1 ml de frio BD Perm / Wash tampão e centrifugação a 800 xg durante 7 minutos a 4 ° C.
15. Aspirar células sobrenadante e ressuspender adicionando 300 ml BD Perm / Wash Buffer frio.
16. Vortex brevemente.
17. Transferir a suspensão enquanto a filtragem para tubos FACS.
18. Manter os tubos em um ambiente escuro e frio até à análise.

Resultados

São apresentados exemplos de análise de citometria de fluxo em células gengivais. Células gengivais agrupados a partir de dois ratos foram executados em um citômetro de fluxo LSR II e analisados ​​usando o software FlowJo. Figura 3A demonstrou a distribuição de células gengivais de camundongos ingênuos em uma dispersão lateral (SSC) em relação ao gráfico de dispersão (FSC). Gating estratégia para identificar (i) os linfócitos (ii) os monócitos / células dendríticas e (iii) os granulócitos é indicado. Pa...

Discussão

Tecidos gengivais Maxilla obtidos a partir de um único rato são suficientes para análise de sub-populações de linfócitos T e B, bem como a sua capacidade para expressar moléculas extracelulares e intracelulares, como previamente descrito ^1. No entanto, se as populações de células raras são de interesse (por exemplo, DCs), recomenda-se a tecidos de piscina 2-3 ratinhos. De nota, se preferível, é possível descascar ambos os tecidos gengivais e palatal e, depois, para extirpar a gengiva (uma modificação do passo...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Colagenase Tipo II	Worthington Biochemical Corp.	CLS-2
DNAse I	SIGMA	DN25-1G
EDTA	SIGMA	E6758-100G
Dulbecco's PBS	SIGMA	D8537
Soro Fetal Bovino	Biological Industries	04-121-1	Filtro Inativado a Vácuo por Calor
Jet	Biofil	FPE-204-500
5 ml Poliestireno Fundo Redondo Tubo	BD Falcon	352052
Cell Strainer 70 μ m	SPL Lifesciences	93070
Placa de Cultura de Tecidos 35× 10 mm	NUNC	153066
BD Cytofix/Cytoperm	BD	554714
Anticorpo anti-camundongo CD11c	Biolegend	117305	Clone N418
Anticorpo anti-camundongo CD45.2	Biolegend	109819	Clone 104
Anticorpo anti-camundongo CD4	Biolegend	100413	Clone GK1.5
Anticorpo anti-camundongo CD8a	Biolegend	100733	Clone 53-6.7
Anticorpo CD3 anti-rato	Biolegend	100214	Clone 17A2
Anti-rato CD326 (Ep-CAM) Anticorpo	Biolegend	118219	Clone G8.8
Anti-rato CD207 (Langerina) Anti-rato		DDX0362D	Clone 929F3.01
Anti-rato I-Ad (MHC-II) antocorpo	Biolegend	115010	Clone 39-10-8
LSR II Citômetro de Fluxo	BD Biosciences
FlowJo Software v 7.6.5	Tree Star