Artigo de método

Accelerated Diabetes Tipo 1 Indução em Ratos por transferência adotiva de diabetogênicos TCD4 +

DOI:

10.3791/50389

⸱

6 de maio de 2013

 , 
1Department of Microbiology & Immunology, Pennsylvania State University College of Medicine

Neste artigo

Resumo

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Nós proporcionar um método reprodutível para induzir diabetes do tipo 1 (DM1) em ratinhos dentro de duas semanas pela transferência adoptiva de células T primárias de ilhéus, CD4 + específicas para o antigénio.

Resumo

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O diabético (NOD) do mouse não obesos espontaneamente desenvolve diabetes auto-imune após 12 semanas de idade e é o modelo animal mais estudada do ser humano diabetes tipo 1 (DM1). Estudos de transferência de células em ratinhos receptores irradiados têm demonstrado que as células T são fundamentais na patogénese T1D neste modelo. Descrevemos aqui um método simples para rapidamente induzir T1D por transferência adoptiva de purificada, as células T a partir de ratinhos NOD pré-diabéticos transgénicas para o receptor de células T específico de ilhota (TCR) BDC2.5 em ratinhos receptores NOD.SCID CD4 + primárias. As principais vantagens desta técnica são que o isolamento e transferência adoptiva de células T diabetogênicas pode ser concluída no mesmo dia, a irradiação dos destinatários não é necessária, e uma elevada incidência de DM1 é induzida dentro de 2 semanas após a transferência de células T. Assim, os estudos de patogénese e intervenções terapêuticas DM1 pode prosseguir a uma velocidade mais rápida do que com os métodos que se baseiam em populações heterogéneas de células T ou clonesderivados de ratinhos NOD diabéticos.

Introdução

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O ratinho NOD espontaneamente desenvolve a diabetes auto-imune e tem sido amplamente utilizada como um modelo animal para 1,2 T1D humano. Patogénese de DM1 em ratinhos NOD é caracterizada pela infiltração de, com início às 3-4 semanas de idade, dos ilhéus pancreáticos de Langerhans por macrófagos e células dendríticas, seguido de células T e B. Esta fase de não-destrutiva peri-insulite leva à destruição lenta e progressiva das células β pancreáticas produtoras de insulina, o que resulta em diabetes evidente por 4-6 meses de idade 3. A transferência de esplenócitos de 4,5, 6,7 ou CD4 + CD8 + 8,9 As células T de ratinhos NOD ....

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Protocolo

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1. Isolamento de células T de baço e linfonodos de BDC2.5 Mice

  1. Use 6 semanas de idade pré-diabéticos do sexo feminino BDC2.5 ratos como doadores de células T CD4 + diabetogênicos. Os ratos devem estar livre de diabetes, conforme determinado por medição de glucose na urina (ver abaixo).
  2. Eutanásia cada rato usando asfixia CO 2 e remover o baço, axilar e braquial gânglios linfáticos sob condições estéreis. Para remover o baço, mergulhe a pele com álcool 70%, em seguida, cortar e retirar a pele. O baço será visível como um órgão de vermelho escuro sobre o lado esquerdo do rato. Adicione uma incisão de 1 cm no peritoneu utilizando as pequen....

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Resultados

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Os nossos resultados mostram o isolamento de células que expressam transgénicos BDC2.5 CD62L, o qual é crítico para as células T para a casa de órgãos linfóides secundários, tais como os nódulos linfáticos pancreáticas. Os resultados demonstram ainda a capacidade potente desta população de células T monoespecífico para transferir rápida e eficientemente a T1D ratinhos receptores NOD.SCID.

Isolamento de células T CD4 + células T diabetogênicas BDC2.5 de ratinhos é mostrado na Figura 2.......

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Discussão

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DM1 pode ser induzida em ratinhos receptores em diferentes eficiências de transferência adoptiva de células do baço inteiro ou subconjuntos de células T a partir de ratinhos NOD diabéticos ou ratinhos transgénicos para TCRs derivados de clones de células T diabetogênicas. Nós relatamos aqui um método reprodutível para induzir DM1 em camundongos receptores dentro de duas semanas a 100% de incidência, transferindo FACS-purificadas CD62L + BDC2.5 CD4 + células T transgênicos em camundongos NOD.SCID.

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Divulgações

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Todos os animais foram alojados na Penn State College of livre de patógenos instalação específica Medicine (SPF), de acordo com as diretrizes da Penn State Institutional Animal Care e do Comitê Use.

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Agradecemos drs. Robert Bonneau e Neil Christensen pelos comentários úteis.

Este trabalho foi apoiado pela Pennsylvania State University College of Medicine fundos.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Camundongos transgênicos BDC 2.5 TCR NOD (NOD. Cg-Tg(Tcrα BDC 2.5, Tcrβ BDC 2.5)JAX004460
NOD. Camundongos SCID (NOD. CB17-Prkdcscid/J)JAX001303
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Themo ScientificSH30022.01
Bayer DiastixFisher ScientificAM2803
Tubos cônicos de 15 mlFalcon352095
Tubos cônicos de 50 mlFalcon352070
Pinças cirúrgicas estéreis Tesouras
pequenas estéreis Tesouras
grandes estéreis
70 μ filtros de células mFisher Scientific22363548
35 μ tubos de tampa de filtro de células mBD Biosciences352235
tampão0,15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0,1 mM Na2EDTA, pH 7,2 em dH2O
BD FACSFlowTM fluido de bainhaBD Biosciences342003
tampãode coloração FACSPBS, 0,2 mM EDTA, 0,5% BSA/FCS, esterilizado com filtro
Microscópio
Azul
Hemocitômetro
Anti-CD4 (APC) mAbBiolegend1005616clone RM4-5
Anti-TCR Vβ 4 (FITC) mAbBD Biosciences553365clone KT4
Anti-CD62L (PE) mAbBD Biosciences553151clone MEL-14
Classificador de célulasBD Biosciencese.g. BD FACSAria III
Lâmpada
Limitador
rato Seringas de 1 mlBecton Dickinson309602
18-1½ agulhas de calibre (estéreis)Becton Dickinson305196
27½ agulhas de calibre (estéreis)Becton Dickinson305109
de cloreto de amônio-potássio (ACK) de contraste de fasede tripanode calor de

Referências

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  1. Makino, S., et al. Breeding of a non-obese, diabetic strain of mice. Jikken Dobutsu. 29, 1-13 (1980).
  2. van Belle, T. L., Coppieters, K. T., von Herrath, M. G. Type 1 diabetes: etiology, immunology, and therapeutic strategies. Physiol. Rev. 91, 79-118 (2011....

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