Nós proporcionar um método reprodutível para induzir diabetes do tipo 1 (DM1) em ratinhos dentro de duas semanas pela transferência adoptiva de células T primárias de ilhéus, CD4 + específicas para o antigénio.
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Artigo de método
Accelerated Diabetes Tipo 1 Indução em Ratos por transferência adotiva de diabetogênicos TCD4 +
Neste artigo
Resumo
Resumo
O diabético (NOD) do mouse não obesos espontaneamente desenvolve diabetes auto-imune após 12 semanas de idade e é o modelo animal mais estudada do ser humano diabetes tipo 1 (DM1). Estudos de transferência de células em ratinhos receptores irradiados têm demonstrado que as células T são fundamentais na patogénese T1D neste modelo. Descrevemos aqui um método simples para rapidamente induzir T1D por transferência adoptiva de purificada, as células T a partir de ratinhos NOD pré-diabéticos transgénicas para o receptor de células T específico de ilhota (TCR) BDC2.5 em ratinhos receptores NOD.SCID CD4 + primárias. As principais vantagens desta técnica são que o isolamento e transferência adoptiva de células T diabetogênicas pode ser concluída no mesmo dia, a irradiação dos destinatários não é necessária, e uma elevada incidência de DM1 é induzida dentro de 2 semanas após a transferência de células T. Assim, os estudos de patogénese e intervenções terapêuticas DM1 pode prosseguir a uma velocidade mais rápida do que com os métodos que se baseiam em populações heterogéneas de células T ou clonesderivados de ratinhos NOD diabéticos.
Introdução
O ratinho NOD espontaneamente desenvolve a diabetes auto-imune e tem sido amplamente utilizada como um modelo animal para 1,2 T1D humano. Patogénese de DM1 em ratinhos NOD é caracterizada pela infiltração de, com início às 3-4 semanas de idade, dos ilhéus pancreáticos de Langerhans por macrófagos e células dendríticas, seguido de células T e B. Esta fase de não-destrutiva peri-insulite leva à destruição lenta e progressiva das células β pancreáticas produtoras de insulina, o que resulta em diabetes evidente por 4-6 meses de idade 3. A transferência de esplenócitos de 4,5, 6,7 ou CD4 + CD8 + 8,9 As células T de ratinhos NOD diabéticos têm mostrado mediar a diabetes em ratinhos NOD imunocomprometidos, indicando que as células T reactivas ilhotas desempenham um papel central na patogénese DM1. Dependendo das condições experimentais, desenvolveram diabetes em ratinhos receptores, lentamente, ao longo de várias semanas nestes estudos. Da mesma forma, vários clones de células T, derivadas por demorado e dispendiosocultura de células T diabetogênicas, têm sido relatados para mediar a diabetes várias semanas após a transferência para ratinhos receptores 7,10. Com a disponibilidade de ratinhos transgénicos que expressam TCR derivados de CD4 ou clones de células T CD8 + restritas diabetogênicas T, vários laboratórios têm subsequentemente demonstrado que as células T do baço de tais ratinhos eram capazes de transferir a diabetes aos receptores 11-13. Especificamente, os ratinhos NOD são BDC2.5 transgénico para a BDC2.5 TCR, que é específico para a cromogranina A, uma proteína em células beta pancreáticas 14-16. Transferência de in vitro ativado ou células do baço inteiro ou fracionado não-ativado a partir abertamente diabéticos ou pré-diabéticos BDC2.5 ratos transferidos diabetes em camundongos NOD neonatais ou imunodeficientes em diferentes eficiências 11,17-19.
Nós descrevemos um método simples que utiliza transgênicos CD4 + purificadas células T de pré-diabéticos BDC2.5 ratos para induzir DM1 em camundongos receptores de alta eficiência e Consistency. Grandes números de células T naive, ilhotas CD4 + específicas para o antigénio são isolados a partir destes ratos por separação de células activadas por fluorescência (FACS) para CD4 + CD62L + células T que expressam a cadeia a de TCR Vβ4 transgénica. Células purificadas transgênicos T são então transferidos sem ativação em camundongos NOD.SCID, que carecem funcionais T e células B e são insulitis e diabetes livre de 20. Os ratinhos receptores são monitorados para elevadas concentrações de glucose na urina, indicando DM1, que se desenvolve rapidamente dentro de duas semanas após a transferência de células T.
Em contraste com outros métodos que transferir células T com especificidades diabetogênicas heterogéneos, o nosso protocolo utiliza células T que expressam quase exclusivamente o diabetogénico BDC2.5 TCR FACS classificados CD4 +. Devido à sua homogeneidade, apenas um pequeno número de células T transferidas (~ 1x10 6 células / rato) são necessários para o desenvolvimento rápido T1D dentro de 2 semanas a 100% de incidência. Outra vantagem é que o nosso protocolo irradiation de ratos destinatário não é necessário, pois é para alguns outros métodos. Uma limitação potencial deste método é que ela não permite a investigação sobre a contribuição de ambas as células T CD8 em diabetes subconjuntos CD4 e CD8 das células T ou especificamente.
O protocolo descrito irá ser útil para estudar o desenvolvimento rápido DM1, mediada por CD4 naive, monoespecíficos + células T, bem como estratégias terapêuticas para intervir na direcção das células Th específicas do antigénio da ilhota para o órgão alvo.
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Protocolo
1. Isolamento de células T de baço e linfonodos de BDC2.5 Mice
- Use 6 semanas de idade pré-diabéticos do sexo feminino BDC2.5 ratos como doadores de células T CD4 + diabetogênicos. Os ratos devem estar livre de diabetes, conforme determinado por medição de glucose na urina (ver abaixo).
- Eutanásia cada rato usando asfixia CO 2 e remover o baço, axilar e braquial gânglios linfáticos sob condições estéreis. Para remover o baço, mergulhe a pele com álcool 70%, em seguida, cortar e retirar a pele. O baço será visível como um órgão de vermelho escuro sobre o lado esquerdo do rato. Adicione uma incisão de 1 cm no peritoneu utilizando as pequenas tesouras e agarrar suavemente o baço, no centro, com um par de pequenas pinças. Aparar cuidadosamente o tecido conjuntivo e gordura em anexo, tanto quanto possível, e remover o baço.
- Recolha as baço e linfonodos em 10 ml de Meio Dulbecco's-Modified Eagle (DMEM), em um tubo cônico de 15 ml no gelo.
- Prepara-se uma suspensão de células individuais utilizando the final de um estéril 10 ml êmbolo da seringa para pressionar suavemente os órgãos linfóides através de 70 filtros de celulares mM (um baço por peneira e 4-6 linfonodos por filtro) no mesmo tubo de 50 ml.
Durante o processo, lavar cada filtro com um ml de DMEM várias vezes para maximizar a recuperação de células a partir do filtro.
- Transferir as células recolhidas a partir do tubo cónico de 50 ml para um tubo cónico de 15 ml e centrifugar a 300-400 x g durante 7 minutos à TA.
- Para lisar as células vermelhas do sangue, descartar o sobrenadante, re-suspender as células em 5 ml de tampão de amónio-cloreto e potássio (ACK) (pH 7,2), e incubar a suspensão de célula ACK à TA durante 5 min.
- Adicionar 10 ml de DMEM para a suspensão de célula ACK e centrifugar o tubo como acima. Lava-se a pelete celular uma vez com 10 ml de DMEM.
2. Separação de células de fluorescência-activated de diabetogênicos TCD4 + de BDC2.5 Mice
- Re-suspender as células em 5 ml FACS scontendo tampão e contar o número de células viáveis (por microscopia de contraste de fase e um hemocitómetro) por exclusão do corante azul de tripano.
- Usando tampão FACS, ajustar o volume da suspensão de células a 5 x 10 7 células / ml. Remover ~ 1 x 10 6 células por controle coloração (1 não mancha, três manchas individuais). Stain a amostra para CD4 transgénicos não activadas + células T com anti-CD4 (APC), anti-TCR Vβ4 (FITC) e (PE), os anticorpos monoclonais anti-CD62L (Acm) em um tubo de 15 ml. Realização da coloração celular, utilizando as concentrações de mAb sugeridas pelo fabricante durante 20-30 minutos a 4 ° C no escuro.
- Lava-se a amostra e controles de manchas individuais com tampão FACS em> 3x o volume da reacção de coloração. Centrifuga-se o tubo a 300-400 x g, remover o sobrenadante, e re-suspender as células em tampão de SCAF (1-2 x 10 7 células / ml de amostra de triagem e 300 ul para os controlos mancha individual) e armazenar em gelo até que o próximo passo.
- Passar a amostra de células através de uma célula de 35 mMtubo de tampa de filtro para remover aglomerados de células. Classificar as amostras de CD4 + TCR Vβ4 + CD62L + células em um classificador de células com um operador treinado. Recolher as células classificadas em 3 ml de DMEM em um tubo de 15 ml. Permitir 2,5-3 horas, incluindo a configuração, para classificar 8 1,5 x 10 células (com o número aproximado de células obtidos a partir de três ratinhos dadores) a uma taxa de tipo de 2 x 10 4 eventos totais / seg. Esperar ~ 2,5 x 10 6 CD4 transgênicos não ativados + células T por rato após separação de células.
- Registe o número absoluto de células classificadas no final do tipo e centrifugar para durante 7 minutos a 300-400 x g. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células (2 x 10 6 células / ml) em fosfato estéril-salino tamponado (PBS) (Mg 2 + / Ca2 + livre) para a transferência adoptiva de células T.
3. Transferência adotiva de diabetogênicos TCD4 + de BDC2.5 Mice
- Usando uma seringa de 1 ml e uma agulha de calibre 18-1 ½, gentilmente re-suspender as células CD4 FACS-purificadas +Células T e carregar a seringa de 1 ml. Em preparação para a injeção, substitua o 18-1 ½ agulha de calibre com uma agulha de calibre 27 ½.
- Expor 6-8 semanas de idade, do sexo feminino ratos destinatário NOD.SCID a uma lâmpada de aquecimento até que exibem comportamento de limpeza.
- Conter em ratinhos receptores limitador e limpar a sua cauda com etanol a 70% (v / v) para desinfectar o local da injecção.
- Injectar 1-2 x 10 6 células / murganho FACS classificados (em até 500 ul de PBS) em qualquer uma das veias laterais da cauda.
Não force o êmbolo. Se a agulha está localizado apropriadamente na veia, a injecção terá lugar com quase nenhuma resistência.
4. Monitoramento Mice destinatário para hiperglicemia e DM1
- Começando cinco dias após a transferência de células T, ratinhos receptores NOD.SCID são monitorados diariamente para glucose na urina elevada usando tiras reagentes (Bayer Diastix) de acordo com as instruções do fabricante. Ratos com duas urin consecutivoleituras electrónicos glicose> 250 mg / dl são considerados diabéticos.
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Resultados
Os nossos resultados mostram o isolamento de células que expressam transgénicos BDC2.5 CD62L, o qual é crítico para as células T para a casa de órgãos linfóides secundários, tais como os nódulos linfáticos pancreáticas. Os resultados demonstram ainda a capacidade potente desta população de células T monoespecífico para transferir rápida e eficientemente a T1D ratinhos receptores NOD.SCID.
Isolamento de células T CD4 + células T diabetogênicas BDC2.5 de ratinhos é mostrado na Figura 2...
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Discussão
DM1 pode ser induzida em ratinhos receptores em diferentes eficiências de transferência adoptiva de células do baço inteiro ou subconjuntos de células T a partir de ratinhos NOD diabéticos ou ratinhos transgénicos para TCRs derivados de clones de células T diabetogênicas. Nós relatamos aqui um método reprodutível para induzir DM1 em camundongos receptores dentro de duas semanas a 100% de incidência, transferindo FACS-purificadas CD62L + BDC2.5 CD4 + células T transgênicos em camundongos NOD.SCID.
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Divulgações
Todos os animais foram alojados na Penn State College of livre de patógenos instalação específica Medicine (SPF), de acordo com as diretrizes da Penn State Institutional Animal Care e do Comitê Use.
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Agradecemos drs. Robert Bonneau e Neil Christensen pelos comentários úteis.
Este trabalho foi apoiado pela Pennsylvania State University College of Medicine fundos.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Camundongos transgênicos BDC 2.5 TCR NOD (NOD. Cg-Tg(Tcrα BDC 2.5, Tcrβ BDC 2.5) | JAX | 004460 | |
| NOD. Camundongos SCID (NOD. CB17-Prkdcscid/J) | JAX | 001303 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Themo Scientific | SH30022.01 | |
| Bayer Diastix | Fisher Scientific | AM2803 | |
| Tubos cônicos de 15 ml | Falcon | 352095 | |
| Tubos cônicos de 50 ml | Falcon | 352070 | |
| Pinças cirúrgicas estéreis Tesouras | |||
| pequenas estéreis Tesouras | |||
| grandes estéreis | |||
| 70 μ filtros de células m | Fisher Scientific | 22363548 | |
| 35 μ tubos de tampa de filtro de células m | BD Biosciences | 352235 | |
| tampão | 0,15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0,1 mM Na2EDTA, pH 7,2 em dH2O | ||
| BD FACSFlowTM fluido de bainha | BD Biosciences | 342003 | |
| tampão | de coloração FACSPBS, 0,2 mM EDTA, 0,5% BSA/FCS, esterilizado com filtro | ||
| Microscópio | |||
| Azul | |||
| Hemocitômetro | |||
| Anti-CD4 (APC) mAb | Biolegend | 1005616 | clone RM4-5 |
| Anti-TCR Vβ 4 (FITC) mAb | BD Biosciences | 553365 | clone KT4 |
| Anti-CD62L (PE) mAb | BD Biosciences | 553151 | clone MEL-14 |
| Classificador de células | BD Biosciences | e.g. BD FACSAria III | |
| Lâmpada | |||
| Limitador | |||
| rato Seringas de 1 ml | Becton Dickinson | 309602 | |
| 18-1½ agulhas de calibre (estéreis) | Becton Dickinson | 305196 | |
| 27½ agulhas de calibre (estéreis) | Becton Dickinson | 305109 |
Referências
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Reimpressões e permissões
