Determinação da Microbial Extracelular Enzyme actividade nas águas, solos e sedimentos, utilizando alta taxa de transferência de microplaca Ensaios

Resumo

Procedimentos em microplacas são descritos para a análise colorimétrica ou fluorimétrica da atividade da enzima extracelular. Estes procedimentos permitem o rápido ensaio de tal atividade em um grande número de amostras ambientais dentro de um prazo administrável.

Resumo

Grande parte da ciclagem de nutrientes e processamento de carbono em ambientes naturais ocorre através da atividade de enzimas extracelulares produzidos por microorganismos. Assim, a medição da atividade dessas enzimas extracelulares pode dar insights sobre as taxas de processos de nível do ecossistema, como a decomposição da matéria orgânica ou de azoto e de mineralização do fósforo. Os ensaios de actividade da enzima extracelular em amostras ambientais tipicamente envolver a exposição das amostras de substratos colorimétricos ou fluorométricos artificiais e rastreando a taxa de hidrólise do substrato. Aqui nós descrevemos os métodos em microplacas para estes procedimentos que permitem a análise de um grande número de amostras dentro de um curto espaço de tempo. As amostras são deixados reagir com substratos artificiais dentro microplacas de 96 poços ou de poço profundo blocos de microplacas, e a actividade da enzima é subsequentemente determinada por absorção ou fluorescência do produto final resultante utilizando uma microplaca Reade típicor ou fluorímetro. Tais procedimentos de alto rendimento não só facilitar as comparações entre os locais ou ecossistemas espacialmente separadas, mas também reduzir substancialmente o custo de tais ensaios, reduzindo os volumes totais de reagentes necessários por amostra.

Introdução

Os microrganismos, tais como bactérias e fungos obter nutrientes e de carbono a partir de compostos orgânicos complexos, através da produção de enzimas extracelulares. Estas enzimas normalmente hidrolisar polímeros em subunidades menores que podem ser tomadas para a célula. Portanto, a nível ecológico, estas enzimas extracelulares microbianos são responsáveis ​​por grande parte da mineralização de nutrientes e decomposição da matéria orgânica, que ocorre em ambientes naturais. Enzimas tais como celobiohidrolase (CBH) e β-glucosidase são importantes para a degradação da celulose e do trabalho em uníssono para catalisar a hidrólise da celulose em glicose ^1,2,

Protocolo

Colorimétrico Análise da atividade da enzima extracelular em solos e sedimentos

1. Preparação do Substrato e Soluções Tampão de Análises colorimétrica de atividade enzimática

1. H preparar 50 mM de tampão de acetato (pH 5,0-5,5) por mistura de 50 ml de 0,1 M de ácido acético (2,87 ml de ácido acético glacial em 500 ml de água), 150 ml de 0,1 M de acetato de sódio, e 200 ml de água destilada ₂ O. Ajustar o pH para 5,0-5,5 com ácido acético 0,1 M, se necessário.
2. Prepara-se uma solução de hidróxido de sódio 1 M (NaOH), em _H2O destilada
3. Preparar soluções de substrato ligado ao NP p em 50....

Resultados

Solos e sedimentos aquáticos têm tipicamente níveis apreciáveis ​​de actividade da enzima extracelular, como resultado de comunidades microbianas acoplados (biofilmes) que crescem na superfície das partículas. Figura 3 mostra como esta actividade muda dependendo do tamanho das partículas obtidas a partir da superfície do sedimento de um terceiro fluxo de ordem no norte Mississippi, EUA. Um estudo anterior demonstrou que as comunidades bacterianas em partículas de sedimentos deste fluxo pode ser dividido.......

Discussão

Determinar a atividade de uma variedade de enzimas extracelulares microbianas em solos e sedimentos pode fornecer informações úteis sobre as taxas de mineralização de nutrientes e processamento de matéria orgânica ^17. No entanto, os solos podem variar em seus níveis de umidade, por isso é importante para padronizar a atividade de peso seco de solo. Isso requer uma etapa de secagem adicional (normalmente de dois dias) além de simplesmente medir a atividade da enzima. Assim, em contraste com os ensaios de activ.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
REAGENTS And MATERIALS
Glacial acético			acid Vários fornecedores
Acetato			Vários fornecedores
Hidróxido de			Vários fornecedores
p-Nitrofenol	Fisher	BP612-1	Alternativas disponíveis
p-nitrofenil (pNP)-fosfato	Sigma	N3234	pNP-substrato
pNP-β-glucopiranosídeo	Sigma	N7006	pNP-substrato
pNP-β-N-acetilglucosaminida	Sigma	N9376	p NP-substrato
Microplacas transparentes de 96 poços	Fisher	12-563-301	Alternativas disponíveis
Blocos de poços profundos de 96 poços
		Pratos de pesagem de alumínio	Vários fornecedores
Tubos			Vários fornecedores
Tubos de centrífuga estéreis de			50 mlVários fornecedores
4-Metilumbeliferona	Sigma	M1381
4-Metilumbeliferil (MUB)-fosfato	Sigma	M8883	MUB-substrato
4-MUB-glucopiranosídeo	Sigma	M3633	MUB-substrato
4-MUB-N-acetilglucosaminida	Sigma	M2133	MUB-substrato
Bicarbonato			Vários fornecedores
Microplaca preta de 96 poços	Costar	3792
Reservatório			Vários fornecedores
EQUIPMENT
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Rotor de centrífuga	Eppendorf	A-4-81	Para microplacas/blocos de poços profundos
Leitor de microplacas	BioTek	Synergy HT	Alternativas disponíveis
Fluorômetro de microplacas	BioTek	FLx 800	Alternativas disponíveis
Pipetador			Vários fornecedores

de sódio sódio Costar 3958 Alternativas disponíveis de centrífuga estéreis de 15 ml de sódio de pipeta de 8 canais