Técnicas de Processamento de Olhos implantados com uma prótese de retina para análise histopatológica localizada

Summary

Técnicas de visualização da retina citoarquitetura diretamente adjacente a eletrodos individuais dentro de um estimulador da retina.

Abstract

Com o recente desenvolvimento das próteses da retina, é importante desenvolver técnicas fiáveis ​​para avaliar a segurança destes dispositivos em estudos pré-clínicos. No entanto, a fixação padrão, para preparação, e os procedimentos automatizados histologia não são ideais. Aqui descrevemos novos procedimentos para avaliar a saúde da retina directamente adjacente a um implante. Próteses de retina possuem matrizes de eletrodos em contato com o tecido ocular. Os métodos anteriores não têm sido capazes de localizar espacialmente o tecido ocular adjacente aos eléctrodos individuais dentro da matriz. Além disso, o processamento histológico padrão muitas vezes resulta em desapego artifactual bruto das camadas da retina quando avaliam os olhos implantados. Consequentemente, tem sido difícil de avaliar os danos localizados, se presente, causado pela implantação e estimulação de uma conjunto de eléctrodos implantados. Por isso, foi desenvolvido um método para a identificação e localização do tecido ocular adjacente ao implante electrodes usando um esquema de marcação corante (código de cores), e modificada uma técnica de fixação dos olhos para minimizar o descolamento de retina artificial. Este método também tornaram a esclera translúcida, permitindo a localização de eletrodos individuais e partes específicas de um implante. Finalmente, foi utilizado um controle pareado para aumentar o poder das avaliações histopatológicas. Em resumo, este método permite a discriminação confiável e eficiente e avaliação da citoarquitetura da retina em um olho implantado.

Introduction

Próteses de retina pode em breve tornar-se intervenções clínicas úteis para o tratamento de várias formas de severa perda de visão. Certas condições, tais como retinite pigmentosa (RP), resultam na degeneração generalizada dos fotorreceptores no olho, que são as células responsáveis ​​pela transdução de luz em sinais neurais. No entanto, algumas células de outras camadas da retina, permanecem e são potenciais alvos para a estimulação eléctrica com uma prótese de retina ^1. Os primeiros resultados de testes clínicos em humanos têm sido promissores para matrizes de eletrodos implantados no epirretiniana ^{2,3, 4,5,} e sub-retiniana intrascleral ^seis localidades. Estes dispositivos são feitos de materiais diferentes, com diferentes formas, mas todos eles usam impulsos eléctricos para activar os neurónios viáveis ​​remanescentes da retina, a fim de criar percepções visuais.

Nosso grupo mais vasto (Bionic Vision Australia) desenvolveu um implante de retina que tem progressed para um estudo clínico piloto com três pacientes RP implantados com matrizes de eletrodos supracoroidal (Número ensaio clínico: NCT01603576). Figura 1A mostra este protótipo suprachoroidal prótese de retina.

A segurança do paciente é fundamental em estudos clínicos e, portanto, antes de iniciar os testes em humanos, foram realizados testes de aguda e crônica extensa em modelos pré-clínicos (Figura 1B). Avaliações histopatológicas foram essenciais para refinar os procedimentos cirúrgicos, percorrer projeto eletrodo e, finalmente, estabelecer a segurança do implante. Para manter um fluxo de trabalho eficiente articulados com as práticas de patologia clínica padrão, uma técnica de inclusão em parafina foi empregado. Também era desejável utilizar procedimentos de coloração comparáveis ​​com os parâmetros clínicos, tais como hematoxilina e eosina (H & E), que são facilmente interpretada pelos patologistas. Nós também queríamos uma técnica que poderia ser adaptado para imunohistoquímica, ema fim de facilitar ainda mais a avaliação celular dos tecidos.

A biocompatibilidade dos materiais de implante, bem como a segurança da estimulação elétrica crônica, precisa ser cuidadosamente avaliada. É importante ser capaz de examinar a histopatologia do tecido ocular adjacente aos eléctrodos estimulantes individuais dentro da matriz. No entanto, as matrizes necessário para ser removida antes do processamento das amostras de modo que podem ser testadas, e porque os seus componentes metálicos não poderia ser facilmente seccionada. Por conseguinte, a preparação de tecido estabelecida não permitem a localização e o mapeamento do tecido em relação aos eléctrodos implantados ^7. Além da falta de um método de localização de tecidos, a fixação à base de formaldeído padrão e técnicas de processamento resultou em artefactos generalizados e descolamento da retina devido à contracção diferencial das diferentes camadas do olho (Figura 2). Devido à não homogeneidade de tele retina, era difícil fazer comparações válidas com o tecido de controle, especialmente para medições quantitativas. Estas limitações combinados complicado avaliações precisas do potencial de danos causados ​​por nossas matrizes implantadas.

Aqui vamos apresentar novas técnicas para superar essas limitações. Temos modificado técnicas de fixação e de processamento especializado olho ^8-10 para manter a compatibilidade com a histologia baseada em parafina. Nós modificamos manchas histológica e imunohistoquímica padrão para dar resultados comparáveis, com base no feedback dos patologistas clínicos. Depois de processar o tecido translúcido escleral, um código de cor à base de corantes foi utilizada para marcar o tecido ocular adjacente a cada um dos eléctrodos individuais, antes de remover a matriz do espaço supracoroidal. Ao marcar o conjunto de eletrodos e os locais de eletrodos individuais, as amostras podem ser coletadas com precisão a partir de regiões adjacentes eletrodos. Amostras pareadas poderiam ser reunidos a partir de diaolho de controlo e, a fim de facilitar as comparações emparelhadas.

Protocol

1. Enucleação e pós-fixação

Este protocolo assume que o assunto foi implantado unilateralmente com um conjunto de eletrodos suprachoroidal.

1. Preparar soluções postfix em garrafas de vidro Schott.
   1. Solução fixadora de Davidson, 2x 100 ml
      • 2 ml de formalina (37% de formaldeído)
      • 10 ml de ácido acético glacial (99,7%)
      • 35 ml de etanol (98%)
      • 53 ml de água destilada
   2. Etanol a 50%, 2x 100 ml
   3. Etanol a 70%, 2x 100 ml
2. Transcardially perfundir sujeito com água morna (37 ° C), seguido por solução salina heparinizada a frio (4 ° C) formalina tamponada neutra (10%).
3. Tie suturas no limbo superior (ou numa localização que é afastada da matriz supracoroídeo) de ambos os olhos - de acordo com um músculo recto, para servir como um ponto de referência.
4. Olhos enuclear, mantendo todas as ligações externas do olho implantado.
5. Coloque each olho em 100 ml de solução de fixador de Davidson e deixar a pós-fixar em temperatura ambiente.
6. Após 18 - 36 h em fixador de Davidson, transferir para etanol a 50% (temperatura ambiente) durante 6-8 horas, em seguida, finalmente, etanol a 70% (temperatura ambiente).
7. Refrigerar as amostras a 4 ° C e armazenar até dissecção.

Globos oculares intactos e pressurizada foram guardados dessa maneira por até 3 meses sem afetar adversamente a histologia resultante.

2. Identificação e Mapeamento de Tissue

O protocolo de fixação acima (passo 1) rendeu o translúcida esclera e da matriz é agora visível - incluindo os locais de eléctrodos individuais (Figura 3).

1. Retire o globo implantado a partir do etanol e aparar cuidadosamente afastado o excesso de tecido, incluindo conjuntiva e cápsula de Tenon. Apare nervo óptico a uma 2-3 mm de comprimento (Figura 3A).
2. Usando um corante histológico marcg esquema, etiqueta dos eletrodos com um código de cor pré-definida, tomando cuidado para não sujar o corante.

• Nós escolhemos uma suíte disponível comercialmente de corante histológico especializado (veja o apêndice). Pequenas quantidades do corante foram cuidadosamente aplicada com um pincel de ponta fina (Roymac tamanho 00) para os tecidos e deixou-se secar ao ar durante até 5 minutos.
• Para os nossos propósitos, nós escolhemos: verde para o eletrodo ativo (s) que foi (foram) estimulado ao máximo, em níveis supralimiares, para a duração do estudo, vermelho para outros eletrodos ativos; amarelo para os eletrodos de retorno de maior diâmetro, e azul para guias adicionais e / ou marcas de distância anatômicas (Figuras 3B e 3C).
• Alguns tentativa e erro poderá ser necessário encontrar um corante que é estável durante os passos subsequentes. Por exemplo, na Figura 4, pode ser visto que o corante verde era mais resistente do que o corante vermelho. A diluição do corante em etanol a 70% ajuda a melhorar penet lípidoração e revestimento de tecido.
• É útil para desenho ou fotografia do mundo tingido para referência futura.

3. Retornar ao etanol a 70% para desidratar o corante.
4. Repita o passo 2.1 para o mundo o controle não implantados.
5. Usando as suturas do passo 1.3, alinhar o olho controle eo olho implantado como um par espelhado.
6. Coloque um molde de silicone (com as mesmas dimensões que a matriz de eléctrodo) na localização espelhado no olho de controlo medida que o implante está localizado no olho implantado (NB a esclera translúcida e as marcações de corantes a partir do passo 2.2 permitir a visualização imediata da posição matriz implantada ).
7. Executar os passos 2.2 e 2.3 para o olho de controlo, de modo que cada local do eléctrodo implantado tem um par de controlo num local anatomicamente comparável (isto é, combinados espelho equivalente).

3. Dissecção e Incorporação

1. Remover o conjunto do implante no olho e remover a parte frontal do olho(Incluindo a córnea, íris e cristalino). Retire o líquido vítreo do olho copo restante (câmara posterior).
2. Dissecar a olho implantado em várias tiras representativas (~ 2 mm de espessura), cada uma contendo um subconjunto das regiões marcadas corante (Figura 3D). Note-se que a orientação das tiras devem ser seleccionadas para ajudar a avaliar os vários aspectos da resposta do tecido ao implante de ^7.

É útil, para referência futura, para fazer um registro de quais regiões corantes estão presentes em cada faixa e as suas posições relativas (e cores).

3. Colocar a tira no seu lado numa piscina rasa de agar liquefeito (4%, 80 - 90 ° C), com o lado a ser cortada primeiro virado para baixo (Figura 3E).
4. Uma vez que o agar estabeleceu, corte ao redor da amostra e colocar em uma fita de tecido suportada por inserções de espuma (Figura 3F).
5. Repita os passos de 3,1-3,3 para o olho controle - takcuidado ing para dissecar espelho pareados tiras.
6. Processar todas as cassetes através de norma técnica (automatizado overnight) o tratamento de parafina.
7. Incorporar tecido processado em parafina com o lado a ser cortado primeiro virado para baixo.

4. Corte e Coloração

1. Cortar blocos de parafina com 5 mm referentes regularmente as notas dos passos 2 e 3.
2. Recolhe secções de cada uma das regiões tingidos e montar em lâminas.

A região imediatamente adjacente a cada ponto tingido de esclerótica podem ser avaliados com a confiança de que era em maior proximidade do eléctrodo correspondente na matriz (Figura 4).

3. Mancha ou executar imunofluorescência como desejado. Exemplo manchas e imunohistoquímica mostrados na Figura 5 são: H &E; Luxol rápido azul (LFB), violeta cresil; tricrômico de Masson azul; ácido periódico de Schiff (PAS); Perls azul da Prússia stana; anti-glutamina sintetase (GS), proteína anti-neurofilamento (NF), anti-proteína acídica fibrilar glial (GFAP) e 4 ',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI).
4. Manchas padrão e especiais foram realizadas conforme detalhado:
   1. H & E coloração foi realizada de acordo com o protocolo fornecido pela Leica Multistainer banho conjunto ST5020 (Leica Biosystems).
   2. LFB e violeta de cresilo (modificado a partir de ^11):
      1. Dewax em 3 mudanças de xileno (3 x 2 minutos) e duas mudanças de etanol (100%, 100%) (2x 1 min) e enxaguados em água da torneira (45 seg.)
      2. Seções hidratar a 95% de etanol.
      3. Coloque em solução LFB ¹¹ a 37-42 ° C (overnight).
      4. Lavar o excesso mancha com etanol 70%.
      5. Enxágüe em água destilada.
      6. Ponto diluído em carbonato de lítio (8%) (alguns segundos).
      7. Diferenciar em etanol a 70% (alguns segundos).
      8. Enxágüe em água destilada.
      9. Repetir os passos para 4.4.2.6 4.4.2.8, se necessário, até background é incolor.
      10. Coloque em solução de acetato de violeta de cresilo a trabalhar a 37 ° C (10 min.)
      11. Não lave em água.
      12. Desidratam em 3 mudanças de álcool absoluto (1 x 30 seg, 20 seg 2x) ​​e 3 mudanças de xileno (1x 1 min 30 seg, 2x 1 min).
      13. Monte e lamela com DPX.
   3. Tricrômico de Masson azul (modificado a partir do ^11):
      1. Dewax conforme 4.4.2.1.
      2. Traga seções para água (2 min).
      3. Stain os núcleos utilizando hematoxilina de ferro de Weigert (2 min.)
      4. Lavar em água corrente, lavar em água destilada.
      5. Mancha em solução de fucsina escarlate ácido Biebrich (5 min).
      6. Enxágüe em água destilada.
      7. Diferenciar em ácido fosfomolíbdico-fosfotungstico até o colágeno é rosa pálido (6 min).
      8. Enxágüe em água destilada.
      9. Contracoloração em azul de anilina (1 min.)
      10. Lavar bem em ácido acético a 1% (1 min.)
      11. Desidratar, montagem e lamela como per 4.4.2.12 e 4.4.2.13.
   4. PAS (modificado a partir de ^11):
      1. Dewax conforme 4.4.2.1.
      2. Oxidar em 1% de ácido periódico (15 min.)
      3. Lavar com água destilada, em seguida.
      4. Mancha em reagente de Schiff (15 min.)
      5. Lavar em água (5 min).
      6. Contracoloração com hematoxilina Harris (1 min.)
      7. Lavar rapidamente em água corrente.
      8. Diferenciar em 0,5% de álcool ácido (1 dip).
      9. Lavar bem em água da torneira.
      10. Azul na água da torneira de Scott (1 min.)
      11. Lavar bem em água.
      12. Desidratar, montagem e lamela conforme 4.4.2.12 e 4.4.2.13.
   5. Perls prussiano mancha azul, tal como descrito em ^11.
5. Imunofluorescência foi realizada como detalhado:
   1. Dewax conforme 4.4.2.1.
   2. Lavar em água destilada (2 x 5 min.)
   3. Executar a recuperação de antigénio utilizando tampão de citrato de 0,01%, um pH de 6 a 75 - 80 ° C (20 min), umad deixar arrefecer em solução tampão de citrato de 0,01% (20 min.)
   4. Lave os cortes em tampão fosfato salino (PBS) (2x 5 min).
   5. Permeabilizar a membrana da célula na solução tampão de lavagem (10 min.)
   6. Incubar em solução de bloqueio de soro (2 h).
   7. Incubar as secções de um único anticorpo primário diluído em diluente de anticorpo (10% de cabra normal serum/0.1% de Triton X-100/PBS) (durante a noite no frigorifico). O título de cada anticorpo primário utilizada é mostrada na Tabela 1.
   8. Após incubação durante a noite, lava secções em solução tampão de lavagem (5x 3 min.) Deste ponto em diante, manter seções no escuro.
   9. Incubar seções do anticorpo secundário correspondente a um título de 1:500 para uma duração específica (ver Tabela 1 para detalhes).
   10. Lavar as secções em solução tampão de lavagem (3 x 5 min).
   11. Incubar as secções em DAPI (1:25.000 / PBS) (30 min.)
   12. Lavar as secções em solução tampão de lavagem (3 x 5 min).
   13. Monte e lamela usando fluorescênciameios de montagem NT.

As amostras de teste e amostras de controle estão prontos para a comparação pareada.

Results

A Figura 4 mostra uma secção representativa proveniente do corte da amostra representada na Figura 3. A secção foi cortado em 5 m de espessura e corados com H & E de acordo com os protocolos descritos acima. A forma grave da tira de amostra é preservada com artefactos do tecido diferenciais mínimas (Figura 4A). Ambas as marcações corante foram visíveis na esclera, embora o corante verde foi mais resiliente do que o vermelho (Figura 4B). As camadas da retina não foram artificialmente destacado e a morfologia da retina é preservado (Figura 4C). O tecido da retina adjacente às marcações de corante, o que corresponde à localização dos eléctrodos na matriz, podem ser prontamente identificados.

A Figura 5 apresenta coloração especial representativo e imuno-histoquímica de secções de tecido preparadas de acordo com o protocolo vigente. Consulte a Figura 5 caption e materiais complementares para obter mais detalhes sobre as manchas específicas e as modificações feitas para o seu uso. Pós-modificação, essas manchas e imunohistoquímica foram equivalentes às normas estabelecidas - como verificado por patologistas.

Tipo de anticorpo primário e título (em parênteses)	GFAP (1:1500)	NF200 (1:100)	GS (1:100)
Tipo de anticorpo secundário e título (em parênteses)	Alexa Fluor 594	Alexa Fluor 488	Alexa Fluor 488
Duração da incubação do anticorpo secundário	1 hr	2 hr	45 min

Tabela 1. Tipo de anticorpos, Titre e duração da rotulagem.

Figura 1. SuprachoroIdal conjunto de eletrodos Prototype. A) fotografia macro de uma matriz moldada grau clínico. B) Fotomicrografia de uma matriz pré-clínicos feitos à mão.

Figura 2. O ex-Histologia da retina. Métodos histológicos padrão foram usadas para preparar estes, H & E manchado, seções de um olho implantado com um conjunto de eletrodos suprachoroidal. A) Uma seção ortogonal através da cavidade conjunto de eletrodos (representado por uma estrela). A retina é separada do tecido ocular externa. Isto é particularmente evidente abaixo da região do implante (seta). É impossível determinar que porção da retina estava adjacente a cada um dos eléctrodos individuais da matriz. Barra de escala = 1 mm. B) A maior ampliação da região em caixa no painel A. Existem vários, regularmente espaçados, artefatos no Laye retinars (setas), assim como um maior distanciamento da camada do tapete (a camada reflectora em olhos felinos). Barra de escala = 100 mm. C) A maior ampliação da região em caixa no painel B. Seta indicou os segmentos exteriores dos fotorreceptores, assim como o epitélio pigmentar, que permanecem intactos, indicando que a separação foi um artefacto efeito colateral do tratamento, em vez de ser causada por um trauma ou in vivo de patologia. Barra de escala = 20 uM.

Figura 3. Localização e dissecção de eletrodo-tecido adjacente. AD) macro fotografias High Dynamic Range de um olho enucleado, com um conjunto de eletrodos suprachoroidal in situ. A) pós-fixados com fixador de Davidson, e antes da remoção da matriz, a esclera translúcido permite a visualização deos eletrodos individuais na matriz (exemplo único indicado com seta). B) Os eletrodos são marcados com uma cor de corante pré-definidos. c) Sinalização de corante em espaçamento regular de marcos anatômicos são usados ​​para manter a consistência entre experimentos. D) Após a remoção do array, o olho é dissecada por mão em tiras de amostra. Setas coloridas indicam dois dos locais adjacentes de eletrodos sobre a esclera. Linha tracejada amarela indica plano de corte. E) Macro-fotografia de faixa de amostra incorporado dentro de um bloco de ágar. F) fotografia Macro da tira amostra agar-embed do Painel E, cortada e colocada em um cassete de incorporação apoiado por almofadas de espuma de biópsia para minimizar o movimento da secção durante o processamento.

Figura 4. Nova Histologia da retina. trong> A tira de amostra de cima (a partir da Figura 3D), contendo o bolso eléctrodo, foi embebido em parafina, seccionados a 5 um e coradas com H & E. A), verde e regiões tintos vermelhos (indicado pelas setas, o mesmo que a Figura 3D) são visíveis nas um corte feito ao nível da linha a tracejado na Figura 3D amarelo. Barra de escala = 1,000 mM. A retina não é individual, nem debaixo do bolso conjunto nem remotamente. B) A região em caixa a partir do Painel A com corante vermelho e verde visível indicado por setas, e retina intacta por toda parte. Barra de escala = 500 mm. C) A região em caixa a partir do Painel B, mostrando a intacto, anexo, retina adjacente ao corante verde. Barra de escala = 50 mm. Sabendo-se que a localização do corante indica a posição de um eléctrodo, que pode avaliar com confiança o tecido da retina adjacente para o dano, caso existam, causada por estimulação eléctrica.

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Figura 5. Exemplos de cytohistochemistry retina modificada utilizando colorações e imunofluorescência. O uso de fixador de Davidson, em oposição a técnicas convencionais de fixação com formalina, necessárias alterações nos protocolos usuais de coloração, tal como descrito no texto principal protocolo. Patologistas confirmaram que estas modificações resultaram na coloração equivalente. D) &E; H hematoxilina manchas púrpura, enquanto os núcleos das células eosina manchas no citoplasma das células, dos tecidos de colagénio e de suporte vários tons de rosa. B) LFB mielina manchas azuis, enquanto a contracorante violeta cresil pode ser usado para . identificar células ganglionares através da coloração corpos de Nissl dentro do azul pericário e destacando as células satélites ao redor das células C) azul tricrômico de Masson, o Biebrich escarlate-fucsina ácida solução manchas muscular fibros vermelha, enquanto as manchas azuis da anilina do colagénio, neste caso, esclera, azul D) de PAS,. componentes da glicoproteína de membrana de base e os componentes do tecido conjuntivo são coradas púrpura, enquanto que a célula de hematoxilina counterstains núcleos roxo E) Perls azul da Prússia.; no local da hemorragia, a formação de hemosiderina degradadas a partir de células vermelhas do sangue e de libertação de complexos de ferro produz uma cor púrpura, enquanto a adição de manchas de cores de vermelho neutro lisossomos vermelho F) GS,. deste neurotransmissor enzima degradante encontrado em células de Müller ¹³ (verde ), pode ser visto que se estende em ambas as direcções, com os corpos celulares Muller, na camada nuclear interna e Müller endfeet celular, formando a membrana limitante interna G) NF-200,. esta cadeia pesada de proteínas do citoesqueleto (verde) encontrada na soma e processos de células , ligações cruzadas com outros neurofilamentos para manter a estrutura de neurónios ^14,15. GânglioAs células e os seus axónios podem ser vistos na camada de células ganglionares e camada de fibras nervosas, enquanto axónios de células horizontais localizadas na fronteira exterior da camada nuclear interna da retina felino, são também realçadas. Contracoloração com DAPI (azul) permite a visualização de camadas da retina H) GFAP,. Esta proteína do citoesqueleto (vermelho) proliferaram em células de Muller e astrócitos durante gliose ^16, pode ser visto que reveste a camada de fibras nervosas com células de Müller formando extensões finas através do interior para camadas externas da retina. Contracoloração com DAPI (azul) permite a visualização das camadas da retina. Barra de escala = 50 mm em todos os painéis. A retina interna é mostrada na parte superior de cada imagem; retina externa é mostrado na parte inferior de cada imagem, excluindo Painel E, que mostra reacção subscleral.

Discussion

Avaliar a segurança do implante é uma consideração primária para estudos pré-clínicos. Antes de uma prótese da retina pode ser implantado em seres humanos, é essencial para verificar que não irá provocar nenhum dano. Isto requer uma avaliação tanto da biocompatibilidade implante ^17-23, bem como os danos potenciais que poderiam ser causados ​​por estimulação eléctrica crónica ^24-26. Experiência com próteses neurais semelhantes, como o implante coclear, fornece insights sobre a ampla gama de estimulação, e, parâmetros físicos que não causam dano tecidual ^27. No entanto, a retina tem características diferentes de outros locais de implantação e os limites de segurança, portanto, precisas (como a densidade de carga máxima) não podem ser assumidos a partir de estudos anteriores em outros sistemas. Densidades de carga são maiores nos locais eletrodo ativo e isso corresponde com o maior potencial de dano. Por conseguinte, um método para localizar o tecido directamente adjacenteaos eléctrodos activos individuais iria aumentar grandemente a utilidade destes estudos. O tecido adjacente a regiões específicas do implante também pode ser destacado para inspecção mais próximo. Esta abordagem orientada permite menos seções a serem analisadas, enquanto a confiança reter que o "pior cenário" foi examinada.

O método de localização corante escleral descrito aqui foi testado extensivamente com a mão em forma de silicone moldado e / PT matrizes de eletrodos ^28-30. Ele tem sido usado com película fina de poliamida matrizes ^{de 7,31} e também de película fina de silicone / PT ³² matrizes. Alguns estudos prótese de retina empregada "bala" em forma de eletrodos com implantes intrascleral ^33. A presente técnica deve ser eficaz para avaliar este tipo de matrizes de eletrodos. Olhos felinos com esclera fino (espessura no pólo posterior 90-200 mm) permitiu a visualização de eletrodos individuais em uma matriz. No entanto, mesmo se electro indivíduodes não eram visíveis, as posições podem ser facilmente inferida usando um molde de silicone quando o contorno da matriz pode ser visto (semelhante ao usado no passo 2.6).

O mapeamento corante limita a necessidade de obtenção de cortes de tecido não-relevantes, apenas seções com o corante presente são obtidos. A capacidade de inferir com precisão a posição do eletrodo não só permite a análise histopatológica relevante e de maior poder estatístico, mas tem um grande impacto no tempo e gestão de custos através da redução da quantidade de lâminas e lâminas utilizados, bem como o custo de mão de obra. O uso do corante que é aderente e podem suportar o processamento do tecido, embora sejam também visível nas secções de tecido não coradas é uma importante consideração inicial. O conhecimento da localização do corante e a orientação do tecido na dissecção e durante a incorporação auxilia o processo de corte. Isto inclui orientar correctamente o bloco para alcançar uma secção que não seja cortada obliquamente e dá um total representatino do tecido. Por conseguinte, é importante que a pessoa que executa o corte está presente no momento da aplicação de corante, a dissecção e a incorporação.

O protocolo geral é robusta para alteração menor, especialmente com tempos de fixação. No entanto, a dissecação do olho e corante passos de marcação são procedimentos delicados que se beneficiam da boa destreza manual para evitar danificar a amostra. Enquanto fixador de Davidson revelou-se eficaz para reduzir desapego artifactual da retina perto de um implante, mas não impede dano mecânico direto, durante a dissecção. Fixador de Davidson não foi prontamente compatível com alguns procedimentos histológicos e imuno-histoquímico especiais. Portanto, houve a necessidade de modificar / otimizar essas etapas, conforme detalhado acima. Mudanças incrementais nos tempos de coloração e as concentrações foram feitas até que o melhor resultado foi alcançado - para mais detalhes, consulte os materiais complementares.

Quantificação da retinahistologia continua a ser problemática. A retina é não homogénea e tanto a espessura e a alteração da densidade de célula com o aumento da distância a partir da área centralis ^34,35. Portanto, o tecido vizinho implantado no interior do olho não pode ser utilizada para comparações e um olho de controlo é empregue em vez disso. Pares correspondentes de cada seção com o olho controle nos dá uma comparação estatística mais poderoso de alterações patológicas, os resultados de eficácia e segurança com próteses de retina são mais bem avaliado quando se comparam os olhos do companheiro em um assunto ^36. Cuidados especiais devem ser tomados para minimizar corte oblíquo como isso afetaria a quantificação.

Em resumo, os métodos descritos acima têm melhorado significativamente a análise histopatológica, que por sua vez conduziu a um fluxo de trabalho pré-clínico mais eficiente. Os resultados dos estudos pré-clínicos utilizando estes métodos conduzido directamente a um ensaio clínico no qual três pacientes de RP foram implantadas de forma segura com suprachoroidal próteses da retina. Estes métodos são relevantes tanto para estimuladores da retina e outros implantes oculares onde a resposta patológica à implantação de longo prazo precisa ser avaliado. Este método forneceu vantagens que valem a pena para a manutenção da citoarquitetura e registro da patologia para regiões de interesse sobre o implante. Embora não seja especificamente ensaiado, uma modificação destes procedimentos podem ser utilizados em outras espécies e outros locais anatómicos, em especial quando uma matriz é implantado superficialmente.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
O sistema de marcação Davidson	Bradley Products	1163-4 - vermelho 1163-5 - azul 1163-2 - amarelo 1163-1- verde
Anticorpo anti-glial anti-glial de proteína ácida anti-glial de coelho	Millipore	AB5804	1:1500, incubação noturna
Anticorpo monoclonal anti-glutamina sintetase de camundongo	Millipore	MAB302	1:100 incubação noturna
Anticorpo monoclonal anti-neurofilamento 200 de camundongo	Sigma-Aldrich	N0142	1:100 incubação noturna
4',6-diamindino-2-fenilindo, dilactato (dilactato)	Life Technologies	D3571	1:25,000 30 min incubação
Alexa Fluor 488 cabra anti-rato IgG	Life Technologies	A11029	1:500
Superfrost 90° amarelo	Grale Scientific	SF41299
Lâminas de Microscópio FLEX IHC	DAKO	K802021-2
Alexa Fluor 594 anti-coelho para cabras IgG	Life Technologies	A11037	1:500
Soro de cabra normal	Life Technologies	PCN5000	10% soro/0.1% Triton X-100/PBS
Non-Standard Solution Preparation for Special Stains 1% Aqueous Cresyl Violet Stock Solution Cresyl violet 1 g Água destilada 100 ml Cresyl Violet Acetate Working Solution 1% aquosa cresyl violet stock solution 9 ml Água destilada 51 ml 10% de ácido acético 0,5 ml Biebrich Solução de Fucsina Escarlate 1% Beihrich escarlate 90 ml 1% fucsina ácida 10 ml Ácido acético glacial 1 ml Solução de ácido fosfomolíbdico-fosftungstico Ácido fosfomolíbdico 2,5 g Ácido fosfotúngstico 2,5 g Água destilada 100 ml Solução de azul de anilina Azul de anilina 2,5 g Ácido acético glacial 2 g Água destilada 100 ml Solutions for Immunohistochemistry Wash Buffer Solution 0,1% Triton X-100 em solução salina tamponada com fosfato (PBS) Solução de bloqueio de soro 10% soro de cabra normal/0,1% Triton X-100 em PBS MATERIAL SUPLEMENTAR Luxol Fast Blue O objetivo de realizar uma coloração Luxol Fast Blue (LFB) foi identificar as células ganglionares na camada de células ganglionares através da contracoloração de violeta de cresila. Enquanto o LFB cora a mielina, a coloração violeta de cresil se liga às substâncias de Nissl nos neurônios, compostas de retículo endoplasmático rugoso e ribossomos. Numerosas células da retina contêm substância Nissl, incluindo células amácrinas. Essas células geralmente estão localizadas na camada limite interna da camada nuclear interna, mas células amácrinas deslocadas podem ser encontradas na camada de células ganglionares. A coloração da substância de Nissl é útil para diferenciar células ganglionares grandes e fortemente coradas de células amácrinas deslocadas menores. Para auxiliar na visualização dessas células, modificamos o protocolo da solução de trabalho de violeta de cresila, aumentando o volume da solução estoque de violeta de cresil na solução de trabalho. Aumentamos o volume em incrementos de 1,0 ml de 6,0 ml para 9,0 ml, reduzindo o volume de água destilada. Avaliando a facilidade de visualização e identificação das células ganglionares, a coloração ideal foi alcançada com 9 ml de solução estoque adicional de violeta de cresil e 51 ml de água destilada. O violeta de cresil é um corante básico, embora para tingir a substância de Nissl, seja necessário usá-lo em uma solução ácida e, portanto, o volume de ácido acético permaneceu inalterado em 0,5 ml. Ácido Periódico Schiff A coloração de Schiff com Ácido Periódico (PAS) foi realizada para destacar polissacarídeos, especialmente glicogênio, encontrados nas membranas basais e nas paredes celulares dos fungos, indicando uma infecção fúngica. O processo da coloração PAS consiste em oxidar os grupos hidroxila em polissacarídeos usando ácido periódico, produzindo grupos aldeídos. A aplicação do reagente de Schiff liga-se aos grupos aldeídos produzindo uma cor magenta com contracoloração de hematoxilina produzindo núcleos de células roxas. Nossas lâminas mostraram coloração fraca na membrana limitante interna. Isso pode ser devido aos polissacarídeos presentes, pois nem todos os polissacarídeos podem ser oxidados com um período de tempo padrão, especialmente aqueles que contêm polissacarídeos aniônicos. Portanto, aumentamos a duração da etapa de oxidação de 10 min para 12, 15 e 20 min. Descobrimos que uma etapa de oxidação de 15 minutos foi mais eficaz na coloração PAS. Masson' s Trichrome Blue O princípio da coloração azul tricrômico de Masson é manchar colágeno e músculo, que em nossas lâminas retinianas podem ser usadas para indicar um aumento no tecido de colágeno que pode indicar fibrose devido a lesão. Esta coloração é sensível às técnicas de fixação, portanto, foram necessárias alterações para obter uma coloração ideal. O processo dessa coloração consiste inicialmente em corar o citoplasma e as fibras musculares de vermelho usando o corante ácido fucsina de ácido escarlate Biebrich. A diferenciação com ácido fosfomolíbdico / fosfotúngstico compete com o corante vermelho nas fibras de colágeno. Na esclera, as grandes moléculas de ácido fosfomolíbdico / fosfotúngstico são capazes de penetrar no tecido conjuntivo frouxo, ao contrário das fibras musculares densas que são penetráveis apenas em pequenas moléculas. O corante azul de anilina é então aplicado para substituir o ácido nas fibras de colágeno que produzem esclera tingida de azul. Para otimizar essa coloração em seções retinianas, a duração da coloração com o corante fucsina de ácido escarlate Biebrich foi reduzida para criar um equilíbrio entre o corante azul e o vermelho. O uso do fixador de Davidson também exigiu um tempo de diferenciação prolongado para remover o corante vermelho do colágeno. Testamos a diferenciação em 5, 6, 8 e 10 min, com resultados ótimos ocorrendo em 6 min. A diferenciação também varia de acordo com a espessura e o corte das seções lisas, com possibilidade de diferenciação superior a 6 min. Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody Polyclonal, a espécie hospedeira é coelho, tem um peso molecular de 50 kDa. O antígeno GFAP é um filamento intermediário encontrado no citoplasma (o citoplasma dos astrócitos e Mü células na retina), o antígeno é feito de 428 aminoácidos e tem um peso molecular de 49512 Da. Neurofilament-200 antibody Monoclonal, a espécie hospedeira é camundongo, clone N52, isotipo IgG1, reconhece as formas fosforiladas e não fosforiladas dos neurofilamentos pesados que têm um peso molecular de 200 kDa. O anticorpo se ligará a um epítopo no domínio da cauda do neurofilamento. O anticorpo corará neurofilamentos na pericaria neuronal, dendritos e axônios. Glutamine Synthetase (GS) anticorpo Monoclonal, clone GS-6, a espécie hospedeira é camundongo, tem peso molecular de 45 kDa e anticorpo isotipo IgG2a. O antígeno GS é encontrado no citoplasma da célula (citoplasma de Mü células na retina), o antígeno tem 373 aminoácidos e um peso molecular de 42.064 Da.