Análise imuno-histoquímica no sistema nervoso central e periférico Rat linfonodo Tissue Secções

Resumo

Apresentamos aqui um protocolo otimizado e detalhado para imunocoloração dupla em seções de tecido do sistema nervoso central (SNC) e linfonodo periférico (LN) de rato fixado em formalina e embebido em parafina.

Resumo

A imuno-histoquímica (IHQ) fornece a visualização de proteínas altamente específico, confiável e atraente. execução correcta e a interpretação de um rotulagem multicolor baseado no IHC é difícil, especialmente quando utilizado para avaliar as inter-relações entre proteínas alvo no tecido com um elevado teor de gordura, tais como o sistema nervoso central (SNC).

Nosso protocolo representa um aperfeiçoamento da técnica de imunomarcação padrão particularmente adaptado para a detecção de ambas as proteínas estruturais e solúveis no rato SNC e nódulos linfáticos periféricos (LN) por neuroinflama�o afectadas. No entanto, com ou sem modificações adicionais, o nosso protocolo poderia provavelmente ser utilizados para a detecção de outros alvos de proteína relacionados, mesmo noutros órgãos e espécies que aqui apresentados.

Introdução

Apesar de a utilização de técnicas avançadas de alto rendimento análises realizadas na methylome, transcriptoma ou até mesmo nível de proteoma, imunocoloração continua sendo o padrão ouro para detecção de proteína directamente na amostra de tecido, cultura celular ou um esfregaço celular. Ao revelar o padrão de localização / distribuição, imuno-histoquímica (IHQ) pode avaliar proporções relativas e inter-relações topográficas das proteínas alvo, e até mesmo indicar as suas atividades biológicas. Portanto, IHC é amplamente utilizada para fins clínicos e de pesquisa, por exemplo, para o diagnóstico, avaliações de tratamento, estudo dos mecanismos da doença, alterações funcionais e fenotípicas em modelos animais, etc.

Compreendendo essencialmente histologia, patologia, bioquímica e imunologia, IHC tem avançado de forma significativa desde 1941, quando os anticorpos marcados com fluorescência foram utilizados pela primeira vez para identificar antigénios pneumocócicos no tecido infectado ^1. Visualization de produtos e componentes celulares por IHC é baseada na ligação de anticorpos (Abs) para o seu antigénio específico (Ag). Além disso, utilizando anticorpos etiquetados fluoróforo, reacções imunes pode também ser visualizada usando enzimas como peroxidase ou fosfatase alcalina ^{2,3 4.} Além disso, os anticorpos marcaram-ouro coloidal ⁵ são usados para detectar a interacção específica antigénio-anticorpo por luz e microscopia electrónica, enquanto marcadores radioactivos são visualizadas por autorradiografia.

A imuno Ag-Ab pode ser detectado através de métodos diretos e indiretos. O método directo é essencialmente mais simples e mais rápido, uma vez que utiliza directamente marcado Abs primária ^6. No entanto, devido à falta de sensibilidade significativa, métodos indirectos são preferidos para os directos. Procedimentos de detecção indirecta duas etapas requerem unlabeled Abs primária, como o primeiro, e rotuladas Abs secundários dirigidos contra o Abs primário, como a segunda camada ^7.amplificação do sinal pode ser conseguida com o envolvimento mais, de enzima acoplada terciária Ab (três passos método indirecto) que se liga ao Ab secundário. métodos de detecção comummente usados ​​são indirectos avidina-biotina peroxidase-antiperoxidase e (PAP). Alternativamente, fosfatase alcalina fosfatase antialcalinos (APAAP) complexo pode ser usado em vez do método PAP. Notavelmente, fosfatase alcalina (AP) métodos parecem ser ainda mais sensível do que os métodos de imunoperoxidase ^4. método de complexo avidina-biotina (ABC) utiliza Ab biotinilado secundário em combinação com avidina marcada com biotina complexo (LAB), ou estreptavidina marcada com biotina complexo (LAJE). A sensibilidade da detecção pode ser adicionalmente aumentada através do envolvimento de avidina marcada com peroxidase ou fosfatase alcalina ^8. Outros métodos de detecção em uso são rotulagem polimérica, amplificação tiramina eo círculo ⁹ imuno-rolamento. Notavelmente, os diferentes métodos de detecção podem ser combinados para a detecção múltipla de Ag no mesmo tecidoamostra, que foi relatada pela primeira vez em 1978 ^4. imunomarcação dupla simultânea aqui apresentado foi realizado em fixado em formol e rato parafinado do SNC e LN cortes de tecidos utilizando anticorpos secundários ligados a peroxidase e AP-conjugados, respectivamente. Os sinais foram visualizados utilizando 3,3'-diaminobencidine cromogénio (DAB) e o Azul Rápido (FB) APAAP complexo, respectivamente.

Protocolo

Declaração de ética
O presente estudo é realizado em conformidade com as orientações do Conselho Nacional Sueco de Animais de Laboratório e a Directiva do Conselho da Comunidade Europeia (86/609 / CEE), sob as licenças éticas N338 / 09, N15 / 10 e N65 / 10, que foram aprovadas pelo Comissão de Ética do Norte Estocolmo animal.

1. Preparação do Tecido

1. Perfusão e fixação
   1. Anestesiar os animais com isoflurano para realizar perfusão transcardial através do ventrículo esquerdo. Inicia-se a lavagem da vasculatura com salina tamponada com fosfato (PBS) para remover os componentes do sangue, seguido por paraformaldeído a 4% em PBS 0,1 M (PFA).
   2. Fixar cérebros dissecados, medula espinhal e tecido LN periférica por imersão em PFA. Após 24 h a 4 ° C, transferir o tecido de PFA em PBS e armazenar a 4 ° C até posterior processamento. Em alternativa ao PBS comercial, dissolver 9 g de NaCl em 250 ml da S &# 246; tampão Rensen e adicionar 750 mL de água desionizada _(dH2O); para preparar tampão 0,2 M Soerensen (pH 7,4) dissolver-se 13,8 g de NaH ₂ PO ₄ x 1H ₂ O e 71,2 g de Na ₂ HPO ₄ x 2H ₂ O em 2,5 L de _dH2O
2. A desidratação e incorporação
   1. Cortar o tecido em cerca de 5 mm de espessura porções utilizando uma lâmina de barbear.
   2. Iniciar o processo de endurecimento do tecido (desidratação), utilizando o processador de vácuo Infiltração ^VIP Tissue-Tek (procedimento padrão com base em submersão em concentrações crescentes de etanol, seguindo-se o xileno e, finalmente, parafina (Tabela 1).
   3. Colocar o tecido em um molde e despeje a parafina líquida em torno da amostra de modo a formar um "bloco de parafina". armazenamento de longo prazo requer temperatura ambiente (RT). No entanto, antes do corte, é recomendável para arrefecer os blocos, por exemplo, durante a noite (O / N) a 4 ° C.

2. Seccionamento

1. Colocar o bloco de parafina em um suporte fixo do micrótomo trenó, que pode mover-se para a frente e para trás através da faca. Ajustar o ângulo óptimo entre o bloco e a faca micrótomo (que depende da geometria da faca, mas também sobre a velocidade de corte e da técnica).
2. Cortar 3-5 mm de espessura secções transversais do bloco de parafina.
3. Transferir secção basta cortar em um recipiente de água e montá-lo posteriormente a partir da água sobre a lâmina de vidro.
4. Pressione a seção montada cuidadosamente contra uma toalha de papel para remover a água residual e bolhas de ar em potencial. Comercialmente pré-revestidos lâminas de vidro adesivas são recomendáveis.
5. Dry slides montados por um par de horas em um fogão em 50 - 60 ° C.

3. desparafinização (Reidratação e bloqueio da peroxidase endógena)

1. Mergulhe as lâminas 2x em xileno (substituto alternativamente xilenoXEM-200), cada período de 15 - 20 '.
2. Enxágüe em 99% de etanol.
3. Para bloquear a actividade da peroxidase endógena, incubar as secções durante 30 minutos em solução de metanol contendo 0,25% de peróxido de hidrogénio.
4. Continuar a reidratação usando etanol com o aumento do teor de água (99%, 70%, terminando-se em água destilada.
5. A partir deste ponto até que a montagem da cobertura desliza seções tem que ser mantido úmido.

4. Antigen Retrieval

1. Usar um vapor de alimentos para ferver as lâminas numa solução de recuperação de antigénio (neste caso de EDTA pH 8,5 tampão) durante 60 '(EDTA solução tampão contém 1,21 g de Tris e 0,37 g de EDTA em 50 ml _{de dH2O;} para preparar o trabalho solução de 2,5 ml de EDTA em solução diluída de 47,5 ml _{de dH2O).}
2. Esfriar as lâminas sobre RT durante aprox. 1 h e, em seguida, lavar 3 - 5x com solução salina tamponada com Tris (TBS, usar alternativamente PBS) que consiste em Tris 0,05 M e NaCl 0,15 M; pH 7,5 ajustado with HCl. Como alternativa, use TBS comercial.

5. O bloqueio dos Sites ligação inespecífica

1. Para evitar reacções inespecíficas fundo, incubar as secções em RT durante 30 minutos na solução de bloqueio contendo 10% de soro fetal de vitelo (FCS) e 90% de tampão DAKO.

6. Faça duplo imunomarcação: incubação simultânea com as Abs primárias

1. Dilui-se a quantidade necessária de anticorpos primários na solução de bloqueio e incubar o / n a 4 ° C. Para o duplo imunocoloração combinar α-eotaxina (CCL11; 1: 300) com α-CD68 (Ed1; 1: 1000) ou α-Iba1 (Aif1, 1: 1000) ou α-CD8a (Ox-8; 1: 200) .
2. Enxaguar as lâminas 3-5x com tampão de TBS (usar alternativamente 10x tampão DAKO diluído).
3. Dilui-se a quantidade necessária de anticorpos secundários (anti-cabra biotinilado e anti-murganho conjugado com AP, tanto 1: 200) em solução de bloqueio e incubar durante 1 h em TA.
4. Lavar as lâminas 3 - 5x com tampão de TBS (use, alternativamente, 10x diluída tampão DAKO).
5. Incubar as lâminas com o complexo de avidina-peroxidase de rábano (HRP), diluído em solução de bloqueio durante 1 h em TA.
6. Lavar as lâminas 3 - 5 vezes com tampão TBS (tampão de usar alternativamente 10x diluída DAKO).

7. Visualization

1. A visualização do anticorpo secundário marcado ligado AP-
   1. Preparar tampão Tris-HCl 0,1 M por dissolução de 12,1 g de Tris em 1 L _{de dH2O} e ajustar o pH para, utilizando HCl. Utilizar o mesmo tampão Tris-HCl para preparar a solução de 1 M de levamisol. Preparar de fresco uma solução a 4% _{de NaNO2} em dH ₂ O.
   2. Para se obter 50 ml do azul (FB) substrato rápido (volume necessário para uma cuvete de vidro padrão) dissolvem 6,25 mg de Naftol-AS-MX-fosfato em 312,5 DMF ul no tubo de vidro e agita-se em 50 ml de pré-aquecido (37 ° C) tampão Tris-HCl. Para dissolver 12,5 mg FB RR sal em 312,5 mL de HCl 2 N adicionar 312,5 ul de previamente prepavermelho 4% de solução de _NaNO2 e agitar a mistura para os mesmos 50 ml de tampão Tris-HCl a pré-aquecido. Agitar suavemente até que o líquido amarelo claro e torna-se, finalmente, adicionar 77 ul de uma solução 1 M Levamisol previamente preparada. Filtrado obtido mistura e despeje em lâminas colocados na cuba de vidro.
   3. Inicia-se a incubação a 37 ° C e controlar processo de desenvolvimento sob a luz do microscópio aprox. cada 15-30 min. Se virando irregular, substitua a solução FB com a nova mistura.
   4. Lavar as lâminas 3 - 5x com tampão de TBS e, subsequentemente, a transferência para tampão de PBS.
2. Visualização do anticorpo secundário biotinilado ligado
   1. Prepare DAB / H ₂ O _{2 a} solução de revelação por diluição de 1 ml de solução de DAB (25 mg de DAB por 1 mL de PBS) em 49 ml de PBS. Adicionar 16.5 ul de H ₂ O ₂ e filtrado antes vertendo-a em secções.
   2. Conversão do DAB cromogénio em precipitando testan pigmento pode ser imediata. Controlar o processo de desenvolvimento sob o microscópio de luz (mesmo par de segundos a mais de incubação pode levantar um fundo de altura e mascarar o sinal específico).
   3. A intensidade do pigmento castanho precipitado pode ser aumentada em alternativa, através de incubação na solução que consiste de 2% de sulfato de cobre e 0,9% de NaCl em 5 '.
   4. Lavar as lâminas 3 - 5 vezes com PBS e finalmente com _dH2O, utilize em alternativa, a água da torneira.
   5. Montar as lâminas com tampa desliza diretamente da água, utilizando meio de montagem GelTol aquosa. Evitar a criação de bolhas de ar.
   6. Permitir a secagem completa do meio de montagem, por exemplo, o / n a 4 ° C. Loja seca lâminas em RT.

1.	% Etanol	20 '	40 ° C
2.	% Etanol	60 &# 39;	40 ° C
3.	% Etanol	90 '	40 ° C
4.	% Etanol	60 '	40 ° C
5.	% Etanol	90 '	40 ° C
6.	% Etanol	60 '	40 ° C
7.	% Etanol	90 '	40 ° C
8.	% Etanol	120 '	40 ° C
9.	xilol	30 '	40 ° C
10.	xilol	60 '	40 ° C
11.	Parafina	60 '	60 ° C
12.	Parafina	60 '	60 ° C
13.	Parafina	60 '	60 ° C
14.	Parafina	120 '	60 ° C

Tabela 1. Processamento de tecido por Tissue-Tek ^VIP Vacuum Infiltração Processor.

Resultados

imunomarcações duplos (co-colorações) foram realizados em fixado em formol e rato parafinado do SNC e LN seções. 3-5 uM fatias de tecido de espessura foram cortadas usando um micrótomo trenó, montado posteriormente em lâminas de vidro pré-revestida com adesivo e tratou-se como anteriormente descrito ^10,11,12. Resumidamente, após deparaffinizing, re-hidratação do tecido e inactivação da peroxidase endógena, as secções foram submetidas ao processo de recuperação de antigénio, se...

Discussão

procedimentos IHC padrão muitas vezes exigem ajustes específicos para obter um ótimo resultado, que normalmente implica uma vasta experiência, mas também abordagem de "tentativa e erro". De preparação do tecido até visualização alvo, quase cada etapa do protocolo pode ser submetido a modificações concebidas individualmente, a fim de melhorar o resultado final. protocolo de coloração dupla aqui apresentado exemplifica proteínas na IHC visando particularmente ajustada para avaliar as inter-relações entre as prot...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagente
Isoflurano (Isoflurano): 1-Cloro-2,2,2-trifluoretilo (éter difluormetílico) 2-Cloro-2-(difluormetoxi)-1,1,1-trifluoretano (C3H2ClF5O)	Baxter	1001936060	Irradiação ocular. Provavelmente influencia a fertilidade e danifica o bebê no útero. Administrar apenas em ambiente anestesiante adequadamente equipado.
Cloreto de sódio (NaCl)	Merck	1.0604
Tampão fosfato salino (PBS), comprimido	Sigma-Aldrich	P4417
Paraformaldeído (OH(CH2O)nH (n = 8 - 100)), 4% em 1x PBS	Apl pharma	34 24 28	Perigo para a saúde. Corrosivo. Inflamável. Toxicidade aguda.
Etanol ≥ 99,5%, absoluto (CH3CH2OH)	Sigma-Aldrich	459844-1L	Flamable.
Xileno (xilenos, grau histológico; C6H4(CH3)2	Sigma-Aldrich	534056	Flamable. Toxicidade aguda.
Cera de Parafina Histo-Comp	Tecido-Tek	V0-5-1001
Lâminas de Microscópio Adesivas	Starfrost	MIC-1040-W
Substituto de xilol XEM-200	Vogel GmbH	ND-HS-200	Sensibilização respiratória. Carcinogenicidade.
α-CD8 (Ox-8) camundongo anti-rato, anticorpo primário	AbD Serotec	MCA48G
α-Iba1 (AIF1) anti-rato, anticorpo primário	Millipore	MABN92
α-CD68 (ED1) anti-rato, anticorpo primário	AbD Serotec	MCA341R
&alfa;-eotaxina C-19 (CCL11) anti-rato de cabra, anticorpo primário	Santa Cruz BT	SC-6181
Anticorpo secundário conjugado com fosfatase alcalina (AP)	Dakopatts, Dinamarca	D0314
Anticorpo secundário biotinilado	Amersham Biotech	RPN1025
complexo Avidin-peroxidase de rábano (HRP)	Sigma-Aldrich	A3151
Naftol fosfato AS-MX (C19H18NO5P)	Sigma-Aldrich	N4875-1G	Toxicidade aguda.
Sal RR azul rápido, Azoic Diazo No. 24 (C15H14ClN3O3 x 1/2 ZnCl2)	Sigma-Aldrich	FBS25
Cloridrato de levamisol (C11H13ClN2S)	Sigma-Aldrich	31742	Toxicidade aguda.
3,3'-Diaminobenzidina tetracloridrato (DAB Chromogen)	DAKO	S3000	Altamente inflamável. Tóxico.
Sulfato de cobre (CuSO4)	Merck	1.02791	Toxicidade aguda. Perturbação ambiental.
GelTol Aquoso Montagem Medium	Thermo Electron Corporation	230100
Peróxido de hidrogênio, 30% (H2O2)	Merck	107210	Toxicidade aguda.
Metanol (CH3OH)	Fluka	65543	Toxicidade aguda. Sensibilização respiratória. Carcinogenicidade. Inflamável.
Tris (hidroximetil) aminometano, base TRIS (C4H11NO3 )	AppliChem	A1379	Irritação da pele e dos olhos.
Solução salina tamponada Tris (TBS), comprimido	Sigma-Aldrich	T5030
Di-hidrogenofosfato de sódio di-hidratado (Na2HPO4 x 2H2O)	Merck	1.0658
Dihidrogenofosfato de sódio monohidratado (NaH2PO4 x 1H2O)	Merck	1.06346
Soro fetal de bezerro (FCS)	Cambrex BioScience	DE-14-802F
Tampão de lavagem de citomação DAKO 10x	DAKO	S3006	Deve ser armazenado a 2-8 &graus; C para inibir o crescimento bacteriano. Evite espuma.
N,N-Dimetilformamida; DMF (C3H7NO)	Fluka	40250	Inflamável. Toxicidade aguda.
Lamínulas de vidro 24 x 36 mm	Menzel-Glä ser	BB024036A1
Ácido clorídrico, conc. (HCl)	Sigma-Aldrich	30721	Corrosivo, irritante, permeador. Sensibilizador pulmonar (como névoa ácida). Tóxico.
Solução de ácido clorídrico volumétrica, HCl 2 M (2 N)	Fluka	71826	Corrosivo, irritante, permeador. Sensibilizador pulmonar (como névoa ácida). Tóxico.
Nitrito de sódio, ReagentPlus, ≥ 99,0% (NaNO2)	Sigma-Aldrich	S2252	Oxidante. Tóxico. Perigoso para o meio ambiente.
Sal dissódico do ácido etilenodiaminotrilotetracético di-hidratado (EDTA; C10H14N2Na2O8 x 2H2O)	Merck	1.08454	As exposições orais podem causar efeitos reprodutivos e de desenvolvimento.
Equipment
Tissue-TekV.I.P Processador de infiltração a vácuo	Sakura	5902 VIP Jr. 115 V, 60 Hz
Hacker-Bright 8000 Series Base Sledge Microtome	Instrumentos
Vaporizador de alimentos domésticos	Braun	MultiGourmet FS 20
Microscópio de luz	Leica Polyvar 2