A Caenorhabditis elegans Sistema Modelo para Estudo Amylopathy

Resumo

Nós descrevemos métodos para estudar aspectos da amylopathies do verme C. elegans. Mostramos como construir vermes expressando ABeta humano ₄₂ Em neurônios e como testar sua função em ensaios comportamentais. Temos ainda mostram como obter culturas neuronais primárias que podem ser utilizadas para testes farmacológicos.

Resumo

Amylopathy é um termo que descreve a síntese e a acumulação anormal de beta-amilóide (Ap) em tecidos com o tempo. Ab é uma característica da doença de Alzheimer (AD) e é encontrado na demência com corpos de Lewy, a inclusão miosite corpo e angiopatia amilóide cerebral ^1-4. Amylopathies desenvolver progressivamente com o tempo. Por esta razão, os organismos simples com tempos de vida curtos podem ajudar a elucidar os aspectos moleculares destas condições. Aqui, descrevemos os protocolos experimentais para estudar a neurodegeneração Aâ mediada através do verme Caenorhabditis elegans. Assim, construímos vermes transgênicos, injetando DNA humano codificação ABeta ₄₂ para as gônadas de hermafroditas sincicial adultos. Linhas de transformantes são estabilizados por uma integração induzida por mutagénese. Nemátodes são sincronizados idade recolhendo e semeando os seus ovos. A função de neurónios que expressam Ap ₄₂ é testada em ensaios comportamentais oportunos (ensaio de quimiotaxias). Culturas neuronais primárias obtidas a partir de embriões são usados ​​para complementar os dados de comportamento e para testar os efeitos neuroprotectores dos compostos anti-apoptóticos.

Introdução

Beta amilóide (Ap) é um péptido de 36-43 aminoácidos que é formada após a clivagem sequencial da proteína precursora de amilóide (APP) por β e γ secretases ^1. A secretase γ processa a extremidade C-terminal do péptido Aíi e é responsável pelos seus comprimentos variáveis ^​​5. As formas mais comuns de Ap são Ap ₄₀ e Ap _42, sendo o último mais comum associado a condições patológicas tais como a AD ^5. Em altas concentrações ABeta forma β-folhas que agregam para formar fibrilas amilóides ^6. Depósitos de fibrilas são o principal componente das placas senis que cercam os neurônios. Ambas as placas e difusíveis, oligómeros de Ap não-placa, são pensados ​​para constituir as formas de Ap patogénicos subjacentes.

Estudo de laboratório de amylopathies neuronais é complicada pelo facto de estas condições o progresso ao longo do tempo. Portanto, é important para o desenvolvimento de animais geneticamente tratável modelos complementares para camundongos com vida curta. Estes modelos podem ser utilizados para elucidar os aspectos específicos de amylopathies-tipicamente celular e molecular, e em virtude da sua simplicidade, para ajudar a captar a essência do problema. O verme Caenorhabditis elegans quedas está nesta categoria. Ele tem uma vida curta, ~ 20 dias e, além disso processos celulares básicos, incluindo a regulação da expressão do gene, o tráfico de proteína, a conectividade neuronal, sinaptogênese, sinalização celular e morte são semelhantes aos dos mamíferos ^7. As características únicas do worm incluem genética poderosos ea falta de um sistema de vasos, o que permite estudar dano neuronal independentemente de dano vascular. Por outro lado, a falta de um cérebro limita a utilização de C. elegans para estudar vários aspectos da neurodegeneração. Além disso, a reprodução e a identificação das distribuições anatómicas de lesões não pode ser executada neste organismo. Outro limiteções incluem a dificuldade para avaliar tanto as diferenças nos perfis de expressão gênica e comprometimento do comportamento complexo e função de memória. Aqui descrevemos métodos para gerar C. modelos elegans de amylopathies.

Protocolo

1. Construção de Worms transgênicos

1. Transformação.
   1. Prepare pastilhas de injeção. Colocar uma gota de água quente, de agarose 2% dissolvido em água, sobre uma lamela de vidro. Colocar rapidamente de uma segunda lamela sobre a queda e leve toque nele. Após a agarose é solidificado, lamelas deslizantes afastados, e cozer a lamela direccional num forno de vácuo a 80 ° CO / N.
   2. Puxe pipetas. Nós usamos um Sutter P-97 extrator para puxar 1/0.5 mm OD / ID borosilicato capilares com filamento. As pipetas são fundidas com a ponta fechada, que está quebrado aberto numa fase posterior.
   3. Prepare mix de injeção. Adicione a mistura de injecção contendo o ADN de interesse (20 ng / mL por construto) mais DNA de plasmídeo vazio a uma concentração final de 150 ng / mL. Centrifugar a mistura de injecção para remover qualquer contaminação. Este passo é essencial porque os contaminantes reduzir a eficiência da transformação. Transferir o topo 5 ul (resíduos e outros contaminantes em recolher o fundo) para um tubo fresco para be utilizado na injecção.
   4. Carregar mix injeção por capilaridade. A parte inferior da pipeta está imerso na mistura de injecção. Normalmente 0,5 mL são suficientes para injetar 100 vermes.
   5. Carregar pipeta de injecção. Insira a pipeta para o titular do micromanipulador e quebrá-lo aberto, esfregando a ponta contra a borda de uma lamínula montado em uma lâmina de vidro ou alternativamente contra detritos no bloco de agarose. Este é um passo crucial como dicas muito grande dano a minhoca e também pequenas dicas são facilmente obstruídos. A qualidade da ponta quebrada pode ser julgada pela forma e, sobretudo, pela taxa de fluxo. O caudal pode ser avaliada através do tamanho das bolhas de fluir a partir da ponta aberta imerso numa gota de óleo 700 halocarboneto, em resposta a uma pressão de injecção.
   6. Transferir vermes pad injeção. Coloque uma gota de óleo de 700 halocarbono sobre uma almofada de injeção e transferir vários (1 ou 2 para iniciantes) vermes para o óleo. Use um verme escolher para empurrar os vermes para baixo sobre o bloco até oy aderir à agarose. Worms deve ser orientada em linhas com os lados ventral na mesma direção. Evite tocar a cabeça do verme. Se, depois de várias tentativas os vermes não aderem à almofada, substitua por uma nova almofada de agarose ou aumentar a espessura e / ou a concentração.
   7. Insira a pipeta no worm. Ao mover o palco, posicionar o verme sob a pipeta. Posicione a pipeta no núcleo central da gônada porque seu citoplasma é compartilhada por muitos núcleos de células germinativas. Isto aumenta a probabilidade de entregar o ADN injectado para muitos progenitura. A pipeta deve ficar quase paralelo ao worm (~ 15 ° -25 °). Empurrar verticalmente a ponta da pipeta para baixo do corpo do verme até que a pele está deprimido. Em seguida, toque suavemente no manipulador para induzir a inserção da ponta. Para melhores resultados injetar tanto gônadas.
   8. Injetar a solução de DNA. Aplique pressão para a pipeta até as ondas gônadas. Interromper o fluxo e puxar o verme para fora da pipeta. Teste da agulha para o fluxo e movapara o outro verme e etapas de injeção de repetição.
   9. Recuperar os vermes: Adicionar uma gota (~ 10 ml) de tampão de recuperação sobre os vermes e incubar até que os vermes começam a natação. Adicionar um volume igual de M9, espere até que os vermes retomar a natação e repetir várias vezes até que a solução é mais M9. Individualmente transferir vermes para placas semeadas.
2. Integração.
   1. Coloque 40 saudável, bem alimentado, L4 vermes em um prato de doce
   2. Irradiar com γ-ray com 4.000 rads por 40 min. Transferir vermes irradiados (P0), em OP50 placas semeadas frescas (4 vermes / placa). Os vermes podem, alternativamente, ser irradiado com uma dose de 300 J / m ² UVs.
   3. Transferir 10-20 transformantes de F1 a partir de cada uma das placas para placas individuais, rotular as placas com o correspondente origem P0.
   4. Destacar 2-4 transformantes F2 para cada F1 para placas separadas. Verifique a progenitura F3 para a transmissão de 100% do marcador de transformação. Normalmente, 1-3% da descendência de um wil verme irradiadoTenho um evento de integração.
   5. As existências de três ou mais linhas transformantes independentes.

2. Os testes comportamentais

1. Age-sincronização.
   1. Crescer vermes em padrão 10 centímetros placas NGM + OP50 E. coli até uma grande população de adultos grávidos é alcançado (3-5 dias).
   2. Recolher os vermes em tubos Falcon de 50 ml de suspensão por eles em 1 ml de tampão M9.
   3. Adicionam-se 5 ml de tampão M9 e centrifugar a 450 xg durante 3 min. Elimine o sobrenadante. Repita 3-4x.
   4. No final da última centrifugação, remove-se o sobrenadante e adicionar 10 volumes de solução de hipoclorito de base (NaOH 0,5 M, 1% de hipoclorito recentemente misturado) para os vermes peletizadas. Incubar à temperatura ambiente durante ~ 10 min. A reacção de lise pode ser monitorizada por colocar uma gota da reacção de lise sobre uma lamela e examinando os vermes ao microscópio. Quando cerca de 80% dos vermes estão quebrados a reação deve ser interrompido.
   5. Parar a reacção de lise por adding o mesmo volume de tampão de ovo esterilizada.
   6. Recolher os ovos (e carcaças) por centrifugação a 450 xg durante 5 min.
   7. Lavar os ovos com tampão de ovo esterilizada 2-3x.
   8. Incubar a ovos de O / N em tampão M9 e sementes los em placas NGM padrão.
2. Ensaio de quimiotaxia.
   1. Prepare vários pedaços de ágar cerca 0.5x0.5x0.5 cm. Nós depositar o agar em uma placa de 10 cm e corte os pedaços de ágar a partir daí.
   2. Embeber o pedaço de agar de uma solução contendo o atraente desejado (em concentrações saturantes, quase saturação) durante 2 horas. Chamarizes típicos são lisina (0,5 M), biotina (0,2 M).
   3. Depositar um pedaço de agar de uma placa de 10 cm de teste em que a localização de um local de teste e um ponto de controlo foram marcadas (Figura 1A). Permitir o equilíbrio e a formação de um gradiente de O / N (Figura 1B). Prepare 5 placas de uma única experiência.
   4. Antes do experimento adicione 10 ml de 20 mM NaN ₃ (Anesthetic) para cada mancha.
   5. Colocar 20 vermes idade sincronizados no centro da placa. Colocar a placa na incubadora a 20 ° C.
   6. Após 1 h, a contagem dos animais sobre os pontos de teste / controlo e calcular o índice de quimiotaxia, (IC), como a seguir: em que N, N e N _{teste Cnt.,} indicam o número total de animais, o número de animais no local de teste e o número de animais no ponto de controlo.

3. Principal Cultura de Células Embrionárias

1. Lyse vermes como descrito na idade de sincronização.
2. Parar a reacção de lise pela adição de igual volume de tampão de ovo esterilizada e centrifugar a 450 xg durante 5 min. Gentilmente elimine o sobrenadante com cuidado para não perder os ovos peletizadas. Repita 2-3x ou até sobrenadante é clara.
3. Ressuspender ovos peletizada (e carcaças) Em 2 ml de tampão de ovo esterilizada e juntar 2 ml de solução estéril de 60% de sacarose em tampão de ovo. Misture esta solução até que os ovos estejam completamente ressuspenso (como eles tendem a formar aglomerados sob centrifugação) com a mão ou em vortex.
4. Centrifugar a 450 xg durante 15 min.
5. Transferir cuidadosamente o sobrenadante (contendo os ovos) para um tubo estéril. Descartar pelete que contém as carcaças e outros subprodutos da lise.
6. Remover sacarose residual por ressuspensão em tampão de os ovos dos ovos e centrifugação a 450 xg durante 5 min. Gentilmente coletar e descartar o sobrenadante. 3x.
7. Sob uma cobertura laminar ressuspender ovos peletizadas em tampão de ovo estéril contendo 1 U / ml de quitinase a RT para digerir as cascas dos ovos. Depois de 30 min começa a controlar a reacção (sob um microscópio invertido de cultura de células). Cada lote de quitinase tem uma actividade ligeiramente diferente. Tipicamente, a digestão é completada em 1 hora.
8. Quando cerca de 70-80% cascas de ovos são digeridos por chitinase add CM-15 (G-15 cultura de células medium contendo 10% de soro fetal bovino, 50 U / ml de penicilina e 50 ug / ml de estreptomicina). Dissociar células usando uma seringa com uma calibre 27. Filtra-se a suspensão de células com 5,0 mM de filtro para remover os embriões intactos, aglomerados de células e larvas.
9. Pellet a suspensão de células dissociadas por centrifugação a 450 xg durante 15 min. Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet em CM-15 de meio de cultura celular.
10. Células dissociadas da placa de vidro sobre a cobertura desliza previamente revestida com lectina de amendoim (0,1 mg / ml) dissolvido em água Nota:. Células devem aderir ao substrato, a fim de se diferenciar.
11. As células podem ser mantidas à temperatura ambiente (16-20 ° C) ao ar durante mais de 2 semanas.

Resultados

Com os nossos protocolos nós estudamos os efeitos do humano ABeta ₄₂ oligômero na função neuronal ^8. Um fragmento de codificação ABeta humano ₄₂ eo sinal peptídeo sequência codificante artificial de Fogo vetor pPD50.52 foi amplificado a partir construção PCL12 ⁹ usando primers que introduziram um Sma uma restrição local endonuclease nas extremidades. O fragmento foi então inserido em uma construção contendo um flp-6 sequência do promotor 2481 pb no vector pPD95.75 fog...

Discussão

Aqui nós descrevemos uma abordagem combinada, para estudar aspectos celulares e moleculares da amylopathies usando C. elegans. As vantagens dessa abordagem incluem: 1.) De baixo custo C.elegans é mantido no prato normal de Petri semeadas com bactérias, à temperatura ambiente. 2) genética poderosas. Os animais transgénicos podem ser obtidos em alguns meses, e uma grande variedade de sequências de promotor está disponível para conduzir a expressão do gene desejado em neurónios específicos. 3) bem caracte...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1. NGM
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S5886	3 g
Ágar bacteriológico	AMRESCO	J637	17 g
Bactopeptona	AMRESCO	J636	2,5 g
Água			Leve a 975 ml
Esterilizado em autoclavagem, adicione os seguintes itens e misture bem
Sulfato	de magnésioSigma-Aldrich	M2643	1 ml de estoque 1 M
Cloreto	de cálcio Sigma-Aldrich	C5670	1 ml de estoque 1
M Colesterol	Sigma-Aldrich	C3045	1 ml de estoque de 5 mg / ml (em etanol)
Tampão			de potássio 25 ml de estoque 1M
Fosfato de potássio monobásico	Sigma-Aldrich	P5655	108,3 g
Fosfato de potássio dibásico	Sigma-Aldrich	P3786	35,6 g
Água			Leve a 1 L
Esterilizado em autoclavagem
3. Tampão M9
Fosfato de potássio monobásico	Sigma-Aldrich	P5655	3 g
Fosfato de sódio dibásico	Sigma-Aldrich	S5136	6 g
Cloreto de sódio	Sigma-Aldrich	S5886	5 g
Sulfato de magnésio	Sigma-Aldrich	M2643	1 ml de caldo 1 M Água
destilada			Leve para 1 L
Esterilizado por autoclavagem
4. Tampão de ovo (pH 7,3, 340 mOsm)
Cloreto de Sódio	Sigma-Aldrich	S5886	118 mM
Cloreto	de Potássio Sigma-Aldrich	P5405	48 mM
Cloreto de Cálcio	Sigma-Aldrich	C5670	2 mM
Cloreto de Magnésio	Sigma-Aldrich	M4880	2 mM
HEPES	Fisher Scientific	BP310	25 mM
		destilada	Traga para 1 L
Esterilizado por autoclavagem
5. CM-15
L-15 meio de cultura	Gibco	11415	450 ml
Soro Bovino Fetal	Gibco	10437-028	50 ml
Penicilina	Gibco	15140	50 unidades/ml
Estreptomicina	Gibco	15140	50 g/ml<
6. Outros Reagentes
Halocarbon 700 óleo	Halocarbon Products	9002-83-9
5 μ m Filtro de seringa Acrodisc	PALL Co.	4199
Quitinase	Sigma-Aldrich	C6137-5UN
Lectina (amendoim)	Hidróxido de sódio Sigma-Aldrich	L0881-10MG
	Fisher Scientific	S320
Lisina	Sigma-Aldrich	L5501
Biotina	Sigma-Aldrich	B4639
Solução	de hipoclorito de sódioSigma-Aldrich	425044
azida sódica	Sigma-Aldrich	71289
Sacarose	Sigma-Aldrich	S0389