Transdução de adenovírus Naive CD4 células T para estudar a diferenciação Treg

Resumo

Adenoviral de transferência do gene em células T CD4 naive com a expressão transgénica do receptor de adenovirus Coxsackie possibilita a análise molecular da diferenciação de células T reguladoras In vitro.

Resumo

As células T reguladoras (Tregs) são essenciais para proporcionar a auto-tolerância imunológica, bem como para certos antigénios estranhos. Tregs podem ser gerados a partir de células T CD4 + naive in vitro com TCR-e co-estimulação na presença de TGF-p e IL-2. Isso tem um enorme potencial para futuras terapias, no entanto, as moléculas e vias de sinalização que a diferenciação de controle são em grande parte desconhecidos.

As células T primárias podem ser manipulados através da expressão ectópica de genes, mas os métodos comuns não conseguem atingir a mais importante do estado ingénuo da célula T antes do reconhecimento do antigénio primário. Aqui, nós fornecemos um protocolo para expressar genes ectópicas nas células T CD4 ingênuas in vitro antes de induzir a diferenciação Treg. Aplica-se a transdução com o adenovírus deficiente em replicação e explica a sua geração e produção. O adenovirus pode demorar até inserções grandes (até 7 kb), e podem ser equipadas com os promotores para alcançar alta e transitória OVEREXPression nas células T. Ele efetivamente transduz células T rato ingênuos se expressar um receptor adenovírus Coxsackie transgênicos (CAR). Importante, após a infecção, as células T permanecem ingénuo (CD44 ^{baixa, alta} CD62L) e de repouso (CD25 ^-, CD69 ^-), e podem ser activadas e diferenciadas em Tregs semelhante a células não infectadas. Assim, este método permite a manipulação de diferenciação de células T CD4 desde o seu início. Ele garante que a expressão gênica ectópica já está em vigor quando os eventos de sinalização início da estimulação inicial TCR induz alterações celulares que, eventualmente, levar em Treg diferenciação.

Introdução

Tregs são cruciais para manter a tolerância imunológica e diminuir as respostas imunes overshooting. Tregs suprimem a ativação de células T espectador. Por conseguinte, a ablação de Tregs conduz à autoimunidade fatal e auto-destruição dirigida por células T activadas ^1. Tregs desenvolvem-se no timo durante a selecção negativa de células T CD4-positivos precursores única, mas também podem diferenciar na periferia das células T CD4 + naive com a estimulação de antigénio de baixa dose com ^1,2 subóptima de co-estimulação. Tímico Tregs parecem suprimir a auto-imunidade de tecidos, contra auto-antigénios, enquanto periférica Tregs têm sido implicadas ....

Protocolo

1. A clonagem de um gene de interesse num vector de entrada

1. Clonar o gene de interesse num vector de entrada. A amplificação por PCR do gene seguido por ligação blunt-end num vector de topoisomerase acoplado (por exemplo, pENTR / D-TOPO) ou enzima de restrição mediada clonagem pode ser utilizado para este procedimento.

2. Transferir o gene de interesse para o pCAGAdDu Destino Vector

1. Transferência do gene de interesse a partir do vector de entrada no vector de destino por LR recombinação (por exemplo, mistura de Gateway LR Clonase Enzima II). Isto irá criar o vector de expressão de adenovírus <....

Resultados

A produção de vírus

Para a geração de títulos elevados de vírus, o período de colheita de células HEK293A na produção de vírus ou de amplificação de primário de vírus é crucial. Representativos fluorescentes e as imagens de contraste de fase com os sinais visuais de produção de vírus estão apresentados na Figura 3. O CPE, foram observadas 10 dias após a transfecção de células com um HEK293A pCAGAdDu vector de controlo sem inserção. CPE são caracterizadas pelo aparecimento de zo.......

Discussão

Geração de vírus e Titulação

Para obter resultados de transfecção ideais, a qualidade ea quantidade de linear vetor aparecem mais importante. Não foram observados efeitos negativos sobre a produção primária a partir de um lisado supercrescimento inicial da cultura, desde a infecção prosseguir rapidamente uma vez que a produção de vírus eficiente ocorre. No entanto, a produção de vírus por células HEK293A pode ser afectada por inserções longas que reduzem a eficiência. Algumas estruturas de leit.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Kit de clonagem pENTR/D-TOPO	Invitrogen	K240020
Gateway LR Clonase II Mistura enzimática	Invitrogen	11791020
PacI	New England Biolabs	R057S
jetPEI	Polyplus-transfecção	101-10N
HEK293A Linha Celular	Invitrogen	R705-07
A549	ATCC	CCL-185
Placas de 6 poços	BD Falcon	353046
Placa de cultura de tecidos de 14 cm	Nunc	168381
BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CARΔ 1) 1Jdgr	Taconic Farms	Modelo Nr. 4285
Naive CD4 + Kit de Isolamento de Células T II	Miltenyi Biotech	130-094-131
DMEM	Invitrogen	41966-052
FBS	PAN Biotech	1502-P110704
PenStrep	Invitrogen	15140-122
RPMI 1640	Lonza	BE12-167F
NaPyruvate	Lonza	BE13-115E
NEAA 100x	Lonza	BE13-114E
L-Glutamina	Invitrogen	25030
Solução tampão HEPES (1 M)	Invitrogen	15630-056
β -Mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M-7522
MEM Mistura vitamínica essencial (100x)	Lonza	13-607C
Dynabeads Mouse T-Activator CD3 / CD28 para Expansão e Ativação Celular	Invitrogen	114-56D
Recombinante Humano TGF-beta 1	R & D Systems	240B
Proleukin S (18 x 106IE)	Novartis
LIVE/DEAD Kit de coloração de células mortas azuis fixável	Invitrogen	L-23105
Mouse BD Fc BlockT	BD Pharmingen	553141
Anti-Mouse/Rato Foxp3 PE	eBioscience	12-5773-82
Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay	Roche Applied Biosystems
Sondas LightCycler 480 Master	Roche Applied Biosystems	04902343001
Kit de Transcrição Reversa de MicroRNA TaqMan	Roche Applied Biosystems	4366596

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