Titulação Bioquímica de glicogênio<em&gt; In vitro</em

Resumo

Descrevemos aqui um método bioquímico exato, reprodutível e conveniente para a titulação de glicogênio in vitro. Esta técnica utiliza o kit de ensaio Abcam do glicogénio e é baseado na hidrólise sucessiva de glicogênio a glicose e glicose titulação por fluorescência.

Resumo

Glicogénio é o principal polímero energético de glicose em animais vertebrados e desempenha um papel fundamental no metabolismo de todo o corpo bem como no metabolismo celular. Já existem muitos métodos para detectar o glicogênio, mas apenas alguns são quantitativos. Descrevemos aqui um método que utiliza o kit de ensaio Abcam do glicogénio, que é baseada na degradação específica de glicogênio a glicose por glucoamilase. A glicose é oxidada então especificamente a um produto que reage com a sonda OxiRed para produzir fluorescência. Titulação é preciso, sensível e pode ser alcançado em extratos de células ou secções de tecidos. No entanto, em contraste com outras técnicas, que não dá informação sobre a distribuição de glicogénio na célula. Como um exemplo desta técnica, descrevemos aqui a titulação de glicogénio em duas linhas celulares de fibroblastos, chinês CCL39 de pulmão de hamster e humanas LS174 carcinoma do cólon, incubadas em normoxia (21% de O ₂₎ contra a hipoxia (1% _de O2). Nossa hipótese é que a hipóxia é um signal que prepara as células para sintetizar e armazenamento de glicogénio, a fim de sobreviver ^1.

Introdução

Glicogénio é um polímero de múltiplas ramificações de resíduos de glicose, que está presente no citoplasma de muitos tipos de células. É uma das principais formas de armazenamento de energia nas células e desempenha um papel importante no metabolismo da glicose. A maioria das células de mamíferos são capazes de produzir e armazenar glicogênio, que pode ser rapidamente degradado em glicose para promover a glicólise e ATP produção durante o estresse metabólico. Hepatócitos produzir grandes quantidades de glicogénio para regular o nível de açúcar no sangue, proporcionando assim um fornecimento contínuo de glicose no corpo. Em contraste, a concentração de glicogénio nos ....

Protocolo

Titulação Bioquímica de glicogênio

1. A lise celular

1. Células de sementes a uma concentração de 0,5-2 x 10 ⁶ por 100 prato mm de diâmetro.
2. Tratamento: incubar células 24, 48, ou 72 horas em baixa concentração de oxigênio (hipóxia), em uma estação de trabalho anaeróbio Bug-Box (Ruskinn Tecnologia Biotrace International Plc, Bridgend, Reino Unido), fixado em 1% ou 0,1% O _2, 94% ou 94,9% de N _2, e 5% de CO _2. Em paralelo, as células incubar em normoxia (21% _de O2, 5% de CO _2). Mudança de meio (meio contendo glicose 25 mM) a cada 24 horas para minimizar as var....

Resultados

Um baixo nível de oxigénio (hipoxia), em sinais de tumores para células de tumor da necessidade de armazenar a energia para lidar com o esgotamento de nutrientes subsequente, a fim de sobreviver. Como o glicogênio é o principal polímero energético da glicose em células de mamíferos, estudamos a regulação do armazenamento de glicogênio em hipóxia. O cálculo e a normalização da concentração de glicogénio nos lisados ​​celulares devem ser realizadas sobre os dados brutos de fluorescência, como mostrado nas Tabelas .......

Discussão

Titulação Bioquímica de glicogênio in vitro permite uma quantificação precisa das células conteúdo de glicogênio. Comparando com outras técnicas (PAS, de imunofluorescência com um anticorpo de glicogénio, etc.), Esta titulação é muito específica, sensível e reprodutível. Além disso, o método é conveniente, uma vez que não necessita de radioactividade mas um espectrómetro de fluorescência. No entanto, esta técnica é puramente quantitativa e não fornece informações sobre a distribuição de glicogênio na c.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
REAGENTS
DMEM	Invitrogen	31966.047
Kit de Ensaio de Glicogênio	Abcam ab65620
PBS
EQUIPMENT
Espectrômetro de Fluorescência	PerkinElmer	LS 50B