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Artigo de método

In situ transversal reto abdominal miocutâneo: um modelo de rato de miocutâneo Isquemia Traumatismo por Reperfusão

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DOI:

10.3791/50473

⸱

8 de junho de 2013

 ,  , 
1Department of Surgery, Royal Infirmary of Edinburgh, 2Department of Nephrology, Royal Infirmary of Edinburgh

Neste artigo

Resumo

Transferência de tecido livre é amplamente utilizado em cirurgia reconstrutiva para restaurar a forma ea função após ressecção oncológica e trauma. Pré-Condicionamento este tecido antes da cirurgia pode melhorar o resultado. Este artigo descreve uma In situ Transversal miocutâneo do músculo reto abdominal (TRAM) em ratos, como um meio para testar estratégias de pré-condicionamento.

Resumo

Transferência de tecido livre é o padrão ouro da cirurgia reconstrutiva para reparar defeitos complexos não passíveis de opções de locais ou aqueles que necessitam de tecido composto. Lesão por isquemia-reperfusão (IRI) é uma causa conhecida de falha de retalho livre parcial e não tem nenhum tratamento eficaz. Estabelecer um modelo de laboratório esta lesão pode custar caro tanto financeiramente como mamíferos maiores são convencionalmente usados ​​e na especialização exigida pela dificuldade técnica desses procedimentos requer tipicamente empregando um microsurgeon experiente. Esta publicação e vídeo demonstram o uso eficaz de um modelo de IRI em ratos, que não requer perícia microcirurgia. Este procedimento é um modelo in situ de um miocutâneo transverso abdominal (TRAM) aba onde são utilizadas pinças atraumáticas para reproduzir a lesão de isquemia-reperfusão associados a esta cirurgia. Um scanner a laser Doppler (LDI) é empregada para avaliar a perfusão aba eo processamento de imagem software, Imagem J para avaliar a área percentual pele sobrevivência como desfecho primário de lesão.

Introdução

O objetivo deste protocolo é demonstrar um modelo confiável e reprodutível da lesão de isquemia-reperfusão observados na transferência de tecido livre para permitir estratégias de intervenção a ser investigado.

Transferência de tecido livre é definido como o descolamento vascular de um bloco isolado de tecido seguido de transplante autólogo de tecido que com anastomose dos vasos seccionados da aba para vasos nativos no local do receptor. O procedimento é conhecido como ITF e do tecido a ser transferida denominada o retalho livre.

Transferência de tecido livre é a abordagem padrão-ouro para a correção de defeitos complexos, compostos onde as opções locais são inadequados ou inexistentes. 1-4 Isquemia reperfusão (IRI) é inevitável em transferência livre de tecidos, contribui para bater falha 5,6 e não tem tratamento eficaz. A natureza eletiva de cirurgias retalho livre permite a administração de farmacologicamenteagentes CAL para precondição contra IRI.

IRI resulta em alterações de fluxo através da microcirculação por activação e disfunção endotelial metabólica, 7 aumento da permeabilidade capilar e edema intersticial 7 subsequente, o influxo de células inflamatórias, 8 de libertação de mediadores inflamatórios, as espécies de oxigénio reactivas 9 e deposição de complemento 10 Este processo complexo de hipóxia. e subsequente reperfusão, finalmente, conduz à morte celular. Um modelo de miocutâneo IRI permite a eficácia do pré-condicionamento estratégias em resultados clínicos para ser avaliado. Trabalhos recentes validou o uso de modelos animais de estudos IRI como um substituto para o IRI humano comparando as alterações moleculares observados em seres humanos e animais de dados existentes 10,11.

O rato miocutâneo transverso do músculo reto abdominal (TRAM) retalho foi descrita pela primeira vez em 1987, em alemão e 12 em 199313 em Inglês. Este modelo ganhou grande popularidade 13-25 como um modelo mais barato, robusto para investigar diferentes estratégias para reduzir IRI associada com a transferência de tecido livre. 14,17-22 A maioria destes estudos foram concebidos como retalhos TRAM unipedicled com base na profunda, inferior, . epigástrica pedículo vascular 15-18,20-22 comparação dos dados destes estudos é dificultada pelo uso de diferentes ilhas cutâneas porte (10,5-30 cm 2) e diferentes comprimentos de acompanhamento pós-operatório (2 - 10 dias). O percentual total área de necrose média aba no braço desses estudos de controle é de 69 ± 6,2% (média ± SEM). Deve notar-se que todos estes seis papéis empregar o músculo rectus abdominis como um portador para o pedículo vascular, mas não expõem, dividir e microanastomose ou prender os vasos. Zhang et al. 23 descreveram um verdadeiro, livre TRAM rato com base nos vasos epigástricos superiores em que o fvoltas foram levantadas, vasos dividido ea retalho miocutâneo transferidos e microanastomosed aos vasos virilha. Esta técnica difícil exigiu a microanastomoses de 0,45-0,5 vasos de calibre mm. Apenas quinze foram realizadas e destas, 67% sobreviveram. 23 O modelo descrito por Zhang et al. 23 é um excelente modelo para o retalho TRAM livre humano como ele realmente reflete a lesão sofrida durante a ITF. Os outros modelos publicados de um retalho TRAM rato refletir com mais precisão as lesões sofridas durante um TRAM pediculado humana, mas não refletem com precisão o IRI como estes aba em não submeter-se a um período de isquemia seguida de reperfusão como o pedículo vascular nunca é preso ou dividido e microanastomoses executadas. Este protocolo e vídeo descreve um novo modelo de transferência de tecido livre usando o TRAM rato em que o IRI é replicado usando microclamps. Este reproduz mais fielmente IRI do que os antecessores TRAM pedículo, mas é tecnicamente mais fácil do que performing a microanastomose. Microclamps têm sido largamente utilizados pelos investigadores transplantados para recriar IRI associada com o transplante de órgãos sólidos; 26-33 contudo, esta é a primeira vez que foi descrito no retalho TRAM rato.

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Protocolo

Toda cirurgia é realizada de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo Ministério do Interior do Reino Unido e da Universidade de Departamento de Serviços de Veterinária de Edimburgo.

1. Surgical set-up Procedimento Notas

  1. Mude para scrubs limpas cirúrgicas, avental, gorro e máscara esfoliante. Limpe todas as superfícies da sala de operações, incluindo equipamentos com clorexidina a 2% em 70% de álcool isopropílico.
  2. Antes da cirurgia, todos os fornecimentos autoclave e instrumentos cirúrgicos que serão utilizados no processo. Embalagens esterilizadas por operação deve incluir: 3 cortinas, gaze, algodão aplicadores ponta, lençóis silicone e os instrumentos cirúrgicos, consulte a tabela de materiais cirúrgicos específicos e ferramentas e Figura 1. Pesa-se o rato e medir o volume apropriado de buprenorfina (0,04 mg / kg) a ser administrado por via subcutânea uma hora antes de completar o procedimento. Lay out, 3 x 1 ml seringas para administração de fluidos por via subcutânea durante surgery, 2 x 6-0 Vicryl, 1 x 5-0 suturas Ethilon, um marcador estéril com régua e um bisturi descartável 10 lâmina, 4-5 pares de luvas estéreis e uma unidade de cautério de mão.
  3. Ponto 4 x 10 ml estéril, 0,9% de solução salina frascos num banho de água aquecido a 37 ° C. Isto irá ser utilizado para a substituição de fluidos por via subcutânea (1 ml / kg / h) e para lavar o local cirúrgico. Configure o cobertor homeotérmicos, sonda retal, lâmpada de calor, microscópio cirúrgico e anestésico rig. Ligue o laser e seu software, set-up um outro equipamento anestésico e coloque uma almofada de calor debaixo do tapete preto em que o animal irá lançar durante a varredura.
  4. Use ratos machos Lewis, pesando 250-300 g. Ratos Casa para 7 dias, com comida e água ad libitum com 12 hr ciclos claro-escuro, antes de qualquer cirurgia é realizada.

2. Anestesia e preparação da pele

  1. Coloque o rato em câmara de indução do equipamento de anestesia e administrar 4% isoflurano com 1l/min O 2 para2-3 min para induzir a anestesia. Remover o rato anestesiado a partir da câmara, e colocá-lo na posição supina, esteira aquecida limpa. Manter isoflurano a 1,5%, utilizando um cone de nariz. Aplicar agente lacrilube ou semelhante para evitar a abrasão da córnea durante o procedimento. Realizar um teste pitada pé-pad para garantir que o animal está devidamente anestesiados antes de prosseguir. Repita esse último teste antes de cada grande passo no processo e ajustar a concentração de anestésico inalatório em conformidade.
  2. Estreitamente raspar a abdominal anterior utilizando uma máquina de barbear de modo que toda a superfície abdominal é exposta. Aplicar depilar creme para a duração recomendado pelo fornecedor. Remover o creme e enxaguar a pele com solução salina estéril aquecido para remover todos os vestígios do creme. Aplicar clorexidina 2% em 70% de álcool isopropílico para a pele e deixe secar antes de prosseguir. Esta é a preparação da pele normal em nossa unidade com base na evidência atual para infecção de sítio cirúrgico. Favor 34 discuss com o seu Departamento de Veterinária que é um procedimento padrão em sua unidade antes de eleger um protocolo de preparação da pele.
  3. Coloque duas cortinas de ambos os lados do rato e cuidar para mantê-los estéreis. Calçar luvas estéreis e com a ajuda de um assistente abrir as embalagens esterilizadas. Coloque todos os instrumentos em uma cortina e as suturas, gazes, aplicadores de algodão, folhas de silicone e caneta marcador estéril com régua na outra.
  4. Identificar a linha média utilizando processo xifóide e a cauda como pontos de referência. Marcar a linha média. Meça 0,8 centímetros abaixo do processo xifóide e marcar este ponto. Desenhar uma linha perpendicular à linha média a partir deste ponto. Tomando a linha média como o centro da marca aba out 1 e 2 cm à esquerda e à direita da linha média. Desenhar linhas verticais paralelas à linha média a partir dos pontos. Medida 4 cm abaixo da linha horizontal original e chamar uma outra paralela a ela. Seguindo estas instruções de 4 x 4 cm aba dividida em quatro tiras iguais é delineada(Ver Figura 2).

3. Laser Doppler

  1. Mova cuidadosamente o rato para o cone do nariz do segundo equipamento anestésico no scanner de LDI. Continuar a anestesia com 1,5% de isoflurano, 1l/min O 2. Ligue o laser e siga as instruções do fabricante para iniciar a digitalização. Depois de salvar o arquivo digitalizado devolver o rato de volta para a primeira plataforma e re-introduzir a sonda retal do cobertor homeotérmicos usando parafina branca e macia como um lubrificante.

. 4 Em TRAM situ - Modelo miocutâneo do IRI

  1. Re-esfrega as mãos e colocar luvas estéreis frescos. Corte um círculo de 5 cm de diâmetro no centro do campo estéril restante e coloque este sobre o abdômen exposto para criar um campo estéril drapeado.
  2. Realizar uma incisão ao longo do bordo lateral esquerdo, marcado (Figura 3A e B). Hemostasia. Fazer incisões semelhantes as linhas horizontaispara a esquerda da linha média. Hemostasia.
  3. A sobrejacente gordura da bainha do músculo reto inferior esquerdo deve ser visível. Utilizando uma pinça e tesouras íris multa cuidadosamente começar por baixo dessa gordura. Tome cuidado para não danificar os perfuradores que vem através do, bainha do músculo reto anterior esquerda. O avião se abriu por essa dissecação é que, imediatamente acima da fáscia da parede abdominal anterior. Continuar dissecando neste plano ao redor das margens demarcadas. Na fossa ilíaca esquerda, encontra-se o grande, superficial ilíaca circunflexo navios de estes podem ser presos ou cauterizada. Em seguida, estender a dissecção medial com cautela e apenas na medida em que a margem lateral do músculo reto abdominal esquerdo. Há uma mudança de cor óbvio neste ponto do rosa ao quase branco (Figura 3C). Irrigar cuidadosamente a área com soro fisiológico estéril e verifique se a hemostasia foi alcançado antes de colocar uma gaze úmida sobre a área.
  4. Repita o procedimento no lado contralateral, mas desta vez estender toa linha alba (linha média). Tome cuidado para identificar e cauterizar todos os perfuradores musculocutâneo que surgem no centro do músculo reto abdominal direito (Figura 3D). Se isso não for feito corretamente, pode resultar em um hematoma pós-operatório e os resultados espúrios. Da mesma forma hemostasia, irrigar e colocar uma gaze úmida sobre a aba levantada.
  5. Voltar para a margem inferior do músculo reto anterior esquerda (Figura 3E e F). Cauterizar o perfurador mais inferior visto. Prossiga para cortar uma pequena janela (cerca de 0,6 centímetros x 0,6 cm) na bainha do músculo reto anterior usando microtesoura e apontou curvo fórceps Graeffe. Blunt dissecar lentamente pela margem lateral do músculo até que o músculo se afina, mas antes da bainha posterior é violada. Em seguida, gire a pinça e sem corte dissecar medial até o ventre do músculo está no topo da borda curvada do fórceps e as pontas são livres na margem medial. Alimente aproximadaly seis centímetros de 5-0 Ethilon nas mandíbulas dos fórceps e amarrar o músculo reto abdominal inferior. Após a conclusão desta etapa, o retalho miocutâneo é isolado em um navio-os dominante vasos epigástricos superiores profundas. Cubra com uma gaze úmida.
  6. Corte a folhas de silicone em ovais com cantos suaves, (Figura 3G). Estes devem ser grande o suficiente para cobrir a maior parte da área exposta sob as porções fasciocutâneos do retalho. No entanto, deve ser tomado cuidado para assegurar que o bordo da pele pode ser fechado sem qualquer tensão e a curva medial da oval pode ter que ser emparelhado de volta para evitar que o fluxo através dos perfuradores prejudicando restantes. Estes são então suturado no lugar com 6-0 Vicryl (Figura 3H). Cubra com uma gaze úmida.
  7. Usando simples interrompido 'peg out' 5-0 Ethilon suturas a aba para reduzir o calor e perda de água (Figura 3I). Cubra com uma gaze úmida.
  8. Estender a ferida superiormente à esquerda doprocesso xifóide (Fig. 3I). Sutura isto para o quadrante superior esquerdo, para melhorar o campo de visão.
  9. Cortar toda a gordura sobrejacente para revelar o, à esquerda, bainha do músculo reto anterior superior. Cortar um pequeno (0,6 cm x 0,6 centímetros) nesta janela bainha (Figura 3J). Estender a ferida medial até que uma alteração na trajectória da fibra muscular da vertical para a consistência e oblíquas a partir cuidadosamente embalados para fibrilas soltas é visto.
  10. Insira as pinças curvas com cuidado entre esses dois músculos e abrir um avião por dissecção romba. Corte com cuidado para baixo apenas na medida em que a superfície superior de estas pinças curvas cortando o ventre do músculo reto abdominal esquerdo para revelar o, artéria subjacente profunda superiores e veia epigástrica (Figura 3K).
  11. Usando micro-instrumentos e de alta potência no microscópio cirúrgico, separe cuidadosamente a artéria e veia e retirar toda a gordura ao redor.
  12. Aplicar grampos Acland atraumáticas para a umartery e veia (B-1, tipo "V") e iniciar o temporizador de contagem regressiva para o período de isquemia de 30 min. Irrigar o pedículo preso e cobrir com gaze. Não foram utilizados vasodilatadores, tais como verapamil ou pabavarine mas deve espasmos nos vasos seja um problema, estes fármacos devem ser considerados.
  13. Administrar o buprenorfina (0,04 mg / kg) e aquecido, solução salina estéril (1 ml / kg / hr).
  14. Começando no canto superior esquerdo, suturar o retalho no lugar com 6-0 subcuticulares Vicryl parar e amarrar no processo xifóide.
  15. Quando o tempo de 30 min de isquemia é longo, remova cuidadosamente os grampos e irrigar o pedículo com soro fisiológico aquecido. Verifique se o fluxo foi restabelecido. Por favor, note que este tempo de isquemia foi estipulado pela autoridade UK Home Office. Os investigadores que trabalham em outras autoridades pode ser capaz de estender esse tempo. Estendendo o tempo de isquemia provavelmente vai levar a pior evolução clínica.
  16. Suturar as bordas do corte do reto de volta no lugar com Vicryl 6-0.Tome cuidado para não aplicar muita tensão, pois isso pode levar a torção dos vasos.
  17. Complete a sutura subcutânea tendo o cuidado de enterrar todos os nós abaixo da pele (Figura 3K).
  18. Limpe a área da ferida e deixe-a secar. Redesenhar as zonas na aba.
  19. Re-examinar o animal para obter uma imagem pós-operatório.
  20. Voltar a aplicar lacrilube para os olhos do animal e colocar num incubador aquecido (37 ° C) durante 1 hora para se recuperar antes de retornar para a unidade de produção.

Etapas críticas dentro do protocolo

O cerne do processo está em identificar os vasos epigástricos profundos superiores. Isto é mostrado claramente no filme que a acompanha. Em breve, uma janela é cortada na aponeurose anterior para expor as fibras musculares subjacentes que será a todo o comprimento. Ao alargar a dissecção superficial da aponeurose anterior medial uma mudança na trajectória da fibra muscular é observada from longitudinal oblíqua. Inserir rombas, curvado, fórceps Graeffe (ou similar), na intersecção dos dois feixes de fibras musculares. Blunt dissecar lateralmente. Cortar, utilizando micro tesouras, sobre a superfície superior das pinças curvas realizadas neste plano entre os feixes de fibras musculares. Na remoção da pinça Graeffe a artéria epigástrica profunda, superior e veia será observada no ponto central do corpo do músculo rectus abdominis. Retirar a gordura recobre os navios que utilizam micro instrumentos e aplicar os grampos.

As porções fasciocutâneos do retalho TRAM de ratos são finas o suficiente para permitir a aba para tomar como um enxerto de pele de espessura total. Para evitar isso e garantir que este é um verdadeiro modelo do IRI uma fina folha de silicone flexível é colocado debaixo das porções fasciocutâneos da aba 35. Esta etapa tem sido adotado por outros pesquisadores que realizam modelos TRAM de ratos. 17,21,25

Rats mastigar atranós gh para se certificar de todas as suturas são subcuticular e todos os nós estão enterrados. No cumprimento meticuloso autocannabilism sutura de retalhos como relatado por outros pesquisadores podem ser evitados. 24

Após a administração de buprenorfina reduzir a manutenção da anestesia com isoflurano a 1% (1l/min O 2).

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Resultados

Modelos de ratos são mais econômicos do que os modelos animais maiores, 36 são resistentes à doença na natureza e podem ser manipulados geneticamente. Animais de pele solta, como roedores, foram pensados ​​para ter um arranjo diferente de fornecimento de sangue cutâneo comparação com os animais esfolados fixos, como os seres humanos e porcos. Em animais de pele soltas, a pele é fornecida principalmente por vasos sanguíneos cutâneos directos que passam pela gordura subcutânea da pele que se sobrepõe (F...

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Discussão

Modificações e resolução de problemas

O protocolo aqui apresentado reproduz o IRI visto na transferência de tecido livre em um sistema experimental que permite ainda mais a compreensão do processo e que proporciona um meio para investigar os meios de melhoramento IRI e melhorar o resultado. Isto pode ser facilmente modificado para produzir uma lesão mais severa, se baseado na não-dominante, profundamente, epigástrica inferior pedículo, ou se o tempo de isquemia foram aumentadas.

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Divulgações

Não temos divulgações.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelo Conselho de Pesquisa Médica concessão G1000299.

O autor correspondente gostaria de agradecer a Gary Borthwick, da Universidade de Edimburgo, para auxiliar durante a cirurgia.

Os autores gostariam de agradecer o conselho de Helen Douglas e Iain Mackay e que nos permite observar a sua epigástrica inferior profunda (DIEP) procedimento aba (Canniesburn Unidade de Cirurgia Plástica, Glasgow Royal Infirmary, 84 Castle Street, Glasgow G4 0SF, UK).

Os autores também gostariam de agradecer a Gary Blackie na Universidade de Edimburgo, por sua ajuda na produção do vídeo para este artigo.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
imagem doppler a laser Moor LD12http://gb.moor.co.uk/product/moorldi2-laser-doppler-imager/8
Sistema completo de manta homeotérmica com sonda flexível. Pequeno. 230 VAC, 50 Hz507221Fwww.harvardapparatus.com
Graeffe pinça 0,8 mm pontas curvas11052-102, http://www.finescience.de
Acland pinças00398 VB-1 ’ V’ grampos de padrão usados em ambas as artérias e veias. http://www.merciansurgical.com/acland-clamps.pdf
AplicadorCAF-4http://www.merciansurgical.com/acland-clamps.pdf
Gemini unidade726067www.harvardapparatus.com
Dilatadores de microvasos 11 cm 0,3 mm pontas 00124D-5a.2http://www.merciansurgical.com
Micro Joalheiros Fórceps 11cm angulado 00109JFA-5bhttp://www.merciansurgical.com
Micro Jewellers Forceps 11 cm reta 00108JF-5http://www.merciansurgical.com
Acland Grampos Simples B-1V (Par)396http://www.merciansurgical.com
Micro Tesouras Cabos Redondos 15 cm Reta67http://www.merciansurgical.com
Iris Tesoura 11,5 cm Curvas EASY-CUTEA7613-11http://www.merciansurgical.com
Mayo Tesoura 14 cm Lâminas Retas Chanfradas EASY-CUTEA7652-14http://www.merciansurgical.com
Derf Porta-agulhas 12 cm TC703DE12http://www.merciansurgical.com
Ethilon 5-0W1618http://www.farlamedical.co.uk/
Vicryl rapide 6-0W9913http://www.millermedicalsupplies.com/
Instrapac - Pinça Dentada Adson (Extra Fina)7973http://www.millermedicalsupplies.com/
Porta-agulhas12565-14http://s-and-t.ne
Heat Lamphttp://www.chicken-house.co.uk
Folha de silicone 0,3 mm translúcidohttp://www.silex.co.uk/
Image J softwarehttp://rsbweb.nih.gov/ij/
Zeiss OPMI picohttp://www.zeiss.co.uk/
Microscópio
Equipamento de isofluorano de solução de tecnologia veterináriahttp://www.vet-tech.co.uk/
isofluorano de solução tecnológica veterináriahttp://www.vet-tech.co.uk/
Scanner de de grampo de cautério Castroviejo cirúrgicoEquipamento de

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