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Artigo de método

Melhoria da preparação e preservação de fatias do hipocampo de camundongos para uma gravação muito estável e reprodutível de potenciação de longa duração

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DOI:

10.3791/50483

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26 de junho de 2013

 , 
1Department of Neurosciences, Research Institute for Biosciences, University of Mons

Neste artigo

Resumo

Este trabalho apresenta uma metodologia completa para se preparar e preservar In vitro Fatias de hipocampo agudos de ratos adultos. Este protocolo permite a gravação de potenciação de longa duração de longa duração muito estável (LTP), durante mais de 8 horas, com uma taxa de sucesso de 95%.

Resumo

A potenciação de longa duração (LTP), um tipo de plasticidade sináptica, caracterizada por um aumento na força sináptica e acredita estar envolvida na codificação da memória. LTP provocada na região CA1 do hipocampo fatias agudas tem sido extensivamente estudada. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes a fase de manutenção deste fenômeno ainda são pouco compreendidos. Isto pode ser em parte devido às várias condições experimentais utilizadas por laboratórios diferentes. Com efeito, a fase de manutenção da LTP é fortemente dependente de parâmetros externos como a oxigenação, temperatura e humidade. É também dependente dos parâmetros internos como orientação do plano de corte e de viabilidade após a dissecação fatia.

A optimização de todos estes parâmetros permite a indução de potenciação de uma muito reprodutível e muito estável a longo prazo. Esta metodologia oferece a possibilidade de explorar os mecanismos moleculares envolvidos no aumento estávelna força sináptica em fatias de hipocampo. Ele também destaca a importância das condições experimentais na investigação in vitro de fenômenos neurofisiológicos.

Introdução

Hoje em dia, há uma compreensão limitada de como as memórias complexas são armazenados e recuperados no nível do circuito neuronal. No entanto, uma hipótese unificadora de armazenamento de memória disponível e largamente aceites: memórias são armazenadas como variações na força das conexões sinápticas entre neurónios no sistema nervoso central. Por si só, a pesquisa sobre a plasticidade sináptica foi amplamente beneficiado com duas descobertas revolucionárias. (1) Num experimento seminal, Bliss e Lomo 1, utilizando o coelho anestesiado intacto, descobriram que a entrega de uma breve alta frequência (1 s, 100 Hz), a estimulação do caminho perfurante do hipocampo causada uma longa duração (vários horas) aumento das conexões sinápticas relacionadas. Este fenômeno fascinante foi chamado de "potencialização de longo prazo", ou PLP por Douglas e Goddard, em 1975 2. (2) Mais tarde, verificou-se que um fenómeno semelhante poderá ser desencadeada em fatias de cérebro (0,4 mm), mantido artificialmente vivo, in vitro . A LTP mais amplamente estudados foi observado in vitro, fornecendo um ou vários tetani a um feixe de axónios (os chamados colaterais de Schaffer) durante a gravação do campo resultante sináptica excitatória potencial evocado nos neurónios piramidais da região CA1 chamada. Os mecanismos de indução da LTP têm sido amplamente revelados. Basicamente, um influxo de Ca2 + através dos receptores NMDA activa enzimas com duas consequências: a fosforilação de receptores AMPA (o que aumenta a sua eficiência) e uma incorporação de receptores de AMPA extra na membrana pós-sináptica 3. Por outro lado, os mecanismos da fase de manutenção da LTP são em grande parte desconhecida, nomeadamente porque é experimentalmente muito mais difícil manter uma fatia saudável durante muitas horas de 30 a 60 min.

Muitos estudos têm sido dedicados à compreensão dos mecanismos de LTP e teorias interessantes foram elaborados ao longo dos anos 4-11. Mas unaté agora, os mecanismos moleculares exactos subjacentes ao aumento estável na força sináptica não foram elucidados. Isto pode ser parcialmente devido à dificuldade para reproduzir os resultados obtidos em laboratórios diferentes, utilizando diferentes técnicas para a preparação e para a manutenção de fatias do hipocampo. Em seu papel metodologia, Sajikumar et al. 12 ressaltou a importância das condições experimentais para a preparação de fatias de hipocampo de ratos e ao registo das LTP estável. Neste vídeo, apresentamos todas as etapas de otimização desenvolvidos em nosso laboratório ao longo dos anos para poder gravar um LTP muito estável em fatias de hipocampo de ratos.

Essa otimização foi feita a partir de protocolos desenvolvidos e utilizados com sucesso por outros laboratórios que estudam mecanismos de LTP em camundongos e ratos 13 11. Ele permite que os investigadores experientes para induzir e gravar uma LTP duradoura por muito tempo em ratos adultos com uma alta taxa de sucesso. O pbase hysiological da LTP induzida foi cuidadosamente verificada e demonstrada 14. Neste trabalho a metodologia, vamos mostrar que qualquer modificação das condições experimentais, como a temperatura ou a oxigenação pode ter um impacto profundo sobre a manutenção LTP enquanto o procedimento de dissecção pode modificar profundamente fatias excitabilidade. Também deve ser enfatizado que o controle preciso de todos estes parâmetros requer um treinamento de vários meses para os alunos novatos.

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Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com o National Institutes of regulamentos de saúde para o cuidado e uso de animais em pesquisa e com o consentimento do comitê de ética local.

1. Preparação de Artificial líquido cefalorraquidiano

Os mesmos meios de comunicação é utilizado para dissecar, cortar e perfundir fatias (1 ml / min) durante o período de repouso e as gravações eletrofisiológicas. Este meio é composto por NaCl 124 mM, KCl 4,4 mM, NaHCO 3 26, 1 mM de NaH 2 PO 4, 2,5 mM CaCl2, 1,3 mM de MgSO4 e 10 mM de D-glucose.

  1. Pesar os componentes diferentes para 2 L de MgSO4 ACSF excepto que já se encontra em solução (1 M). Usando uma solução padrão permite ter a certeza da exata concentração de Mg 2 + porque MgSO4 em pó é altamente higroscópico. Ca 2 + e Mg 2 + rácio influencia grandemente a indução e manutenção da LTP14 e, assim, as proporções devem ser sempre respeitados.
  2. Coloque todos os componentes, exceto CaCl2 num cilindro de vidro graduado e trazer a 2 L com H2O destilada
  3. Mexa vigorosamente. Quando tudo está dissolvido, adiciona carbogénio através de um borbulhador de aquário e tubo ligado ao tanque (95% O2, 5% de CO 2). Espere alguns minutos e adicionar cloreto de cálcio, quando o pH é fixado em 7,4 por acção de tampão de bicarbonato.
  4. Manter a 600 ml num prato de vidro rectangular refrigerado e arrefecer a 4 ° C com gelo em volta do prato. Este meio será utilizada para dissecação do hipocampo.
  5. Filtre os restantes 1.400 ml e manter-se em um erlenmeyer.

2. Preparação do Rig eletrofisiológica ea Slice câmara de gravação Cérebro

O circuito de perfusão é feita de duas bombas peristálticas, um bombeamento de fluidos frescos de um tanque de reserva e outro de bombeamento de fluido usado de tele gravar câmara a um bin. Fluido fresco é adicionada a um sistema de perfusão caseira, onde é re-oxigenada e aquecida antes de atingir a câmara de registo de interface, por gravidade (Figura 1A). A câmara de gravação interface foi projetada pelo FST (Belas Tools Ciência, em Vancouver, Canadá, Figura 1B). Fatias de tecido são colocados em rede tecida filtro ligado a um anel bem removível e pode ser mantida continuamente sob condições de interface, ajustando a altura da agulha de aspiração bem. Um tubo de plástico caseira bloqueado na sua extremidade e perfuradas lateralmente (0.5 mm) é fixada à agulha de sucção para aumentar a estabilidade do nível da câmara. A cabeça de gravação é montada sobre um banho de água contendo uma pedra de dispersão de gás que ajuda a manter um ambiente húmido passando o ar húmido através de portas de deflexão da cabeça de gravação (para diminuir a formação de gotículas de água). Banho e temperatura do meio é controlado por variação contínua do nível de corrente DC tháspero um silicone de borracha incorporado elemento de aquecimento em banho-maria. Termistores em banho de água e poços de gravação permitir que a temperatura da câmara para ser fixado e precisamente controlada nestes locais.

O sistema de aquecimento da câmara é completado por um sistema de aquecimento global, controlando a temperatura de toda a plataforma. O software desenvolvido por pesquisadores da University of Edinburgh ( www.etcsystem.com ) monitora e equilibra a temperatura do ar oxigenado, a fatia do cérebro, os eletrodos eo equipamento restante proporcionando um ambiente estável para gravações de longa duração (Figura 1C) . A temperatura utilizada para fatias de hipocampo de ratos é de 28 ° C.

  1. Lavar todo o circuito de perfusão com H 2 O destilada por um período mínimo de 20 min e iniciar os sistemas de aquecimento.
  2. Iniciar o borbulhamento carbogénio no circuito. Carbogen chega nas home-made tubos de perfusão através de fvelas ILTER e no banho de água abaixo da câmara de gravação. O caudal do banho de água é controlada por um medidor de fluxo. Se o caudal for demasiado lento, o tecido pode tornar-se hipóxico. Por outro lado, se o caudal for demasiado elevado, o gás pode não ser suficientemente aquecido e hidratada levando a secagem do tecido. Taxa de fluxo de gás de alta poderia também aumentar a possibilidade de a pulverização de água sobre o tecido a partir do banho de água abaixo levando ao choque osmótico. Isto pode ser evitado pela adição de pedaços de rede de nylon (100 um) na saída das portas de deflexão.
  3. Escorra o circuito e encher com ACSF filtrada.
  4. Coloque o anel que irá apoiar a fatia na câmara de retenção. Um filtro de rede tecida com aberturas de malha de 500 a 750 um é esticado e ligado ao anel com resina de duas partes de cola epóxi. O filtro de rede de tecido é feito de 87% de poliamida e 13% elastano (calça 15 den). Cola deve ser aplicado com cuidado para evitar a formação de relevos na superfície da ring.
  5. Remova cuidadosamente todas as bolhas de ar do circuito.
  6. Ajustar o nível de ACSF na câmara de registo com o parafuso da agulha de aspiração. A velocidade das bombas peristálticas é ajustado para 1 ml / min para a entrada da bomba e a 5 ml / min, para a saída da bomba.

O sistema de perfusão é colocado sobre uma mesa de vibração rígida resistente e rodeado por uma gaiola de Faraday.

3. Preparação da área de dissecção

Instrumentos cirúrgicos: um bisturi com lâmina n º 11, tesoura pequena padrão de dissecação, tesouras, pinças de mola curvas, duas Heidemann espátulas e uma colher.

Material suplementar: uma guilhotina, um resguardo, um triturador de tecido Mcllwain, com uma lâmina de barbear, papel de filtro, uma pipeta de Pasteur de vidro com uma tetina de borracha, duas pipetas de Pasteur de plástico uma das quais com uma boca larga, uma placa de Petri, um cilindro metálico 7 mm de diâmetro (Figura 2A).

  1. no prato de dissecação enchido com ACSF gelado (preparada no Passo 1), mergulhar uma tampa de vidro refrigerado a partir de uma placa de coloração, embrulhado em papel de filtro. Cuidadosamente remover bolhas de ar e oxigenar a ACSF através de um borbulhador de aquário (Figura 2A).
  2. Lay out instrumentos em ordem de uso. Adicionar três camadas de papel de filtro na placa de triturador de tecido e uma lâmina nova lavados com água destilada e com éter (Figura 2B). A lâmina deve ser horizontal quando toca o papel. Força da lâmina é ajustada a metade do valor da velocidade máxima e a cerca de um terço do valor máximo.
  3. Atentamente verificar se tudo está pronto (instrumentos, temperatura ...), porque você não vai ter tempo depois.
  4. Peça a alguém para pulverizar a dissecção com uma pipeta Pasteur preenchido com ACSF frio.
  5. Anestesiar o rato com IP Nembutal (100 mg / kg) antes de decapitação. Anestesia halotano também podem ser usadas. Comparamos os dois métodos e obtainada mesmos resultados. Decapitação deve ser realizada sob anestesia mas deslocamento cervical também podem ser utilizados. No entanto deslocamento cervical precisa de uma boa prática para evitar o sofrimento do animal.
  6. Dissecar no resguardo tão rapidamente quanto possível, sob frio ACSF contínuo banho.

4. Remoção cérebro

  1. Enquanto ainda segurando a cabeça com o dedo indicador eo polegar de uma das mãos sobre a boca, fazer uma incisão com a tesoura de dissecção ao longo do meio do topo da cabeça começando na borda do corte guilhotina e funcionando rostralmente até o osso frontal .
  2. Cortar o músculo cutâneo em cada lado da cabeça para expor totalmente as placas do crânio e remover os músculos na parte lateral da cabeça do caudal.
  3. Com as tesouras de dissecação, cortados do músculo temporal de cada lado, ao longo da placa temporal, depois cortar as placas frontais no meio, transversalmente. Em seguida, fazer um pequeno corte no osso occipital, entre os dois plates.
  4. Para cada um dos lados, cortadas na base caudal das placas occipitais.
  5. Corte ao longo da sutura sagital com uma tesoura de mola.
  6. Com uma pinça, retire as metades do crânio, espalhando-los longe um do outro.
  7. Com o bisturi, cortar transversalmente logo após o bulbo olfatório e pouco antes do cerebelo, em seguida, mergulhar o cérebro extraído no prato de dissecação com ACSF frio.

5. Dissecção do hipocampo

  1. Uma vez que o cérebro está imersa no prato de dissecação, separar os dois hemisférios do outro com um bisturi inserido no meio.
  2. A dissecção do hipocampo é realizada com espátulas sob controle visual por meio de um microscópio cirúrgico binocular (X25, Figura 2A). Em um hemisfério, cuidadosamente espalhar as estruturas para ver o ventrículo lateral. Remover o tronco cerebral e diencéfalo. Isto é feito pela aplicação da espátulas no córtex frontal de um lado e do diencéfalo naoutro lado. Tome cuidado para não tocar no hipocampo com o espátulas e não esticá-lo durante o corte do tecido.
  3. Sever do fornix então empurre o hipocampo fora do córtex (rolar), através da inserção de uma espátula no ventrículo.
  4. Quando o hipocampo é extraído, remover o excesso de tecido cortical e restantes vasos sanguíneos.

6. Corte das fatias

  1. Com um plástico de boca larga pipeta Pasteur, transferir o hipocampo em uma colher com seus Alvear para cima da superfície (lado convexo).
  2. Remover o excesso de fluido com uma pipeta de Pasteur de plástico normal.
  3. Dica a colher verticalmente quase tocando o papel de filtro do helicóptero (Figura 2B) e cair fora do hipocampo da colher, tocando rapidamente o papel de filtro, em seguida, voltar a colher.
  4. Orientar o hipocampo e corta transversalmente a 400 m com o helicóptero (ver Figura 2C para orientação do hipocampopus em relação à lâmina de barbear). Aja tão rapidamente quanto possível.
  5. Retire o papel de filtro com o hipocampo fatias e envolvê-la em torno do cilindro metálico para espalhar as fatias um pouco. Então, sem as fatias com sprays de ACSF usando um padrão de plástico pipeta Pasteur e coletá-los em uma placa de Petri cheia de ACSF frio.

7. Incubação de fatias em interface

  1. Seleccione fatias com uma pipeta de Pasteur de plástico padrão e colocá-los rapidamente na câmara de gravação. Fatias recuperar do trauma dissecção directamente na câmara de gravação, em relação a 28 ° C.
  2. A fatia será mais provável pia. Diminuir o nível de fluido para atingir o nível fatia, e, em seguida, aumentá-lo para fazê-lo flutuar.
  3. Vire a fatia na posição correta, baixando o nível. As fatias são sempre orientada da mesma forma a facilitar o posicionamento dos eléctrodos (2 estimulante e um eléctrodos de registo), na região CA1.
  4. Pare quandoo fluido está na interface. Um "menisco" dos meios de comunicação em torno da fatia é indicativo de um nível suficiente de meios de comunicação. O filtro de rede deve ser saturado com a mídia, mas não completamente submerso.
  5. Manter a câmara coberta com papel de filtro colocado sobre a tampa perfurada.
  6. Deixe o resto fatia de pelo menos 1,5 horas a 28 ° C.

8. Gravação de respostas sinápticas

  1. Gravação de eletrodo: capilares de vidro são puxados para obter uma resistência de ponta de 2-5 mohms quando preenchidos com ACSF. Um pequeno pedaço de papel de filtro é colocado em torno da ponta do eléctrodo e cera óssea é aplicada na extremidade para reduzir a condensação. Eletrodos estimulantes: eletrodos bipolares de cluster de platina-irídio, com um diâmetro de 12,5 m são comprados de FHC (EUA). Com os devidos cuidados, cada eletrodo pode ser usado pelo menos 30 vezes (Figura 1B).
  2. Posicione os eletrodos na radiatum estrato da região CA1, todos os eletrodos alinhadoscima (Figura 3A). Os eléctrodos são reduzidos 75-150 mM sob a superfície da fatia com micromanipuladores Narishige. Os dois eletrodos estimulantes são colocadas para estimular a dois pacotes distintos de Schaffer garantias. Quando os eletrodos são rebaixados para a fatia, papéis de filtro são cuidadosamente colocados ao redor para fechar a câmara.
  3. Estimulação bifásica (0,08 ms de duração de pulso por meio de ondas) é realizada em tensão constante com um estimulador de grama ligado a unidades de isolamento SIU-V. Resposta máxima é verificada, aumentando a intensidade do estímulo de 2 V a 12 V. máximo EPSP de campo são amplificados 1000 vezes com um WPI ISO-amplificador 80 e filtrada em 10 Hz e 10 kHz. O sinal é então enviada para um PC através de uma National Instrument conversor A / D. Estimulação, aquisição e análise de dados são realizadas utilizando o programa WinLTP ( www.winltp.com ). EPSP de campo são registados a 40% da amplitude máxima obtida numa entrada Saídacolocar curva. Para cada fatia, as encostas fEPSP são normalizados contra a inclinação média do min 30 precedendo indução da LTP.
  4. A LTP é desencadeada pela aplicação de um único trem de estimulação (100 Hz) para testar a força de uma via enquanto o segundo percurso serve como controlo.

9. A limpeza do Setup

  1. Lavar todo o circuito, com uma solução a 3% de peróxido de hidrogénio (H 2 O 2) durante pelo menos 10 min, depois drenar. O circuito terá de ser cuidadosamente lavado com água destilada antes de começar cada experiência. O uso de H 2 O 2, não é absolutamente necessário que outros laboratórios utilizam apenas água destilada para a limpeza, mas notamos a deposição de resíduos escuras no sistema tubagem quando se utiliza apenas água.
  2. Substituir a água em banho-maria sob a câmara de gravação.
  3. Banheira as dicas eletrodos estimulantes no álcool por 5 min.

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Resultados

Esta metodologia foi utilizada para analisar as propriedades de potenciação de longa duração a longo prazo induzida em fatias de hipocampo agudas a partir de ratos adultos (C57Bl/6J JANVIER SAS, França) 14. Surpreendentemente, a melhoria das condições experimentais levou a uma nova forma de olhar para a LTP. Nós mostramos que o aumento de longa duração em sináptica não exigem a síntese de novas proteínas.

Aqui, vamos mostrar que a indução de LTP depende fatias de viabilidade e exc...

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Discussão

Temos desenvolvido no nosso laboratório um protocolo que resulta da combinação de métodos desenvolvidos e utilizados por outros laboratórios têm uma grande experiência na LTP gravações 11,17. Este protocolo é adaptado para hipocampo do rato adulto e pode ser usado em animais de qualquer idade e qualquer genótipo de fundo. Ele também permite a análise da LTP em camundongos transgênicos desenvolvimento de doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer 18,19.

A uti...

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Divulgações

Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

Agradecemos Bernard Foucart para assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pelo Fundo Belga para a Investigação Científica (FRS-FNRS) e pelo Fundo Rainha Elisabeth de Pesquisa Médica. Agnès Villers é pesquisador do Fundo Belga para a Investigação Científica.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Reagent/Material
NaClSigma - AldrichS7653
NaHCO3Sigma - AldrichS8875
KClSigma - AldrichP9333
D-glicoseSigma - AldrichG7528
NaH2PO4 Sigma - AldrichS9638
MgSO4 1MSigma - Aldrich63126
CaCl2Sigma - AldrichC4901
CarbogenAir Liquide (Bélgica)
CapilaresWPI, Inc. (Reino Unido)TW150-4
Eletrodos EstimulantesFHC (EUA)CE2B30
Ferramentas cirúrgicasFST (Alemanha)
Papel de filtro 84 g/m2SartoriusFT-3-105-110
MeshLycra15 den
GlueUHUplus endfest300
Instrument
AmplifierWPI, Inc. (Reino Unido)ISO-80
Câmara de gravação de interfaceFST (Alemanha)
Bombas peristálticasGilson (EUA)Minipuls 3
Controlador de temperaturaUniversidade de Edimburgowww.etcsystem.com
Helicóptero de tecidosMcllwain
EstimuladoresGrass (USA)S88X + SIU-V
Análise do programaWinLTPwww.winltp.com
MicromanipuladoresNarishigeMM-3 e MMO-220A
Microscópio cirúrgicoLeica Microsystem
conversor A/DNational InstrumentsNIPCI-6229 Série
M

Referências

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